[发明专利]一种干涉膨胀素基因Exp2制备植物悬浮培养小细胞系的方法

权利要求书

一种干涉膨胀素基因Exp2制备植物悬浮培养小细胞系的方法。其特征是：

1.构建膨胀素基因Exp2的RNAi表达载体工程菌。利用Genbank报道的膨胀素基因核苷酸序列，选择两段保守性较高的核苷酸区域分别作为正向片段(I和II)，并以其为依据分别设置其对应的反向序列(I’和II’)，通过比对Genbank注册的植物膨胀素基因Exp2的核苷酸序列，选定其两个保守区分别为正向片段I、II以及对应的反向序列I’和II’；构建I-AC-II’-II-CT-I’的RNAi片段；筛选出插在pCAMBIA2300表达载体并能转化植物细胞的工程菌。

2.从外植体诱导早期愈伤组织；早期愈伤组织与根瘤农杆菌工程菌共培养；随后在含抗生素的培养基中进行选择培养，筛选出抗性愈伤组织并进行继代培养；将松散的抗性愈伤组织在液体培养基振荡培养；培养物过筛后继续进行振荡悬浮培养，获得稳定的悬浮细胞系。

3.利用看护培养手段，从悬浮细胞中筛选生长速度快的单细胞系愈伤组织；将该愈伤组织在液体培养基中振荡培养；培养物过筛后继续进行悬浮培养，获得由单细胞和小细胞团组成的悬浮系；对该悬浮系的细胞形态大小、生长周期、主要代谢产物含量及其稳定性等进行鉴定，最后获得的悬浮细胞作为种子进入大规模培养。

4.通过培养基和培养条件的优化，获得植物细胞生长和产物积累的最适碳氮源、pH、温度、溶氧量和最佳接种量等主要发酵工艺参数。