[发明专利]一种利用中国石蒜叶片组培快繁的方法

说明书

1.技术领域

本发明涉及一种利用中国石蒜的叶片组织建立无菌培养体系快速培养再生植株的方法。 

2.背景技术

中国石蒜Lycoris chinensis属石蒜科Amaryllidaceae石蒜属Lycoris植物，广泛分布于东亚地区，在国内主要分布于长江流域以及西南诸省，以其独特的龙爪形花瓣而著称，花朵色彩艳丽，花形优美，是一类优良的球根花卉植物和药用植物。目前，已在华东地区的城市绿化中得到应用，但是，自然条件下，中国石蒜主要依靠鳞茎分球进行繁殖，繁殖系数较低，难以满足大规模的生产需要。由于快繁技术措施的滞后，园林应用与药用的采挖已严重影响其野生资源的数量，部分地区的野生种群已遭到毁灭性破坏，因此，解决其快繁技术问题已成为中国石蒜野生种群保护与园林生产应用的关键。 

组织培养技术作为植物品种快繁的主要手段已在鳞茎类植物中得到较为广泛的应用，它可以大幅度提高鳞茎的繁殖系数，满足中国石蒜快速大规模繁育生产的需要。尤其是利用中国石蒜的叶片作为外植体材料，进行诱导培养，并再生植株的新技术，不但能够实现中国石蒜的快速商业化生产，还具有不破坏母鳞茎、保护珍稀种质的优点，对于中国石蒜野生种群的保护具有特殊意义。 

CN102217540A公开了周坚的“一种中国石蒜的快速繁殖方法”发明专利技术，以中国石蒜的种胚为外植体，诱导再生植株，这种方法虽然繁殖系数较高，但种子的遗传背景较复杂，繁育出的后代性状有分离现象，限制了中国石蒜纯系品种的推广应用。而且以种胚作外植体只能一次性使用，采用叶片作外植体则可以多次采集并保存原鳞茎。 

3.发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是利用中国石蒜的叶片组织建立无菌培养体系培养再生植株。 

解决上述技术问题的技术方案是按如下步骤进行： 

(1)培养基配方和配制 

适宜外植体幼嫩叶片诱导的培养基配方：MS+6-BA 20mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L 

适宜无菌小叶诱导的培养基配方：MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L 

继代培养培养基配方：MS+6-BA 0.5mg/L+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L 

生根培养培养基配方：1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L 

具体的配制方法： 

A、按照MS培养基配方，把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类，每一类中各种药品分别称量，可按照一定倍数配制浓缩液，然后按照顺序量取所需体积混合在一起，最后加蒸馏水，定容至1 升； 

B、然后加入蔗糖、琼脂，调节ph值至5.9，微波炉加热，煮沸至溶液中琼脂完全溶解呈透明为止； 

C、将配制好的培养基分装在事先准备好的培养瓶中，1L一般可分装成20-22瓶，然后盖上盖子并注明标签。最后将用牛皮纸包好的培养皿、滤纸以及蒸馏水一道进行高压灭菌，灭菌温度为121℃，维持时间18-25min； 

D、灭菌过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，放置24小时后使用，一般应在灭菌后的两周内用完。 

(2)叶片采集和处理 

A：采集中国石蒜幼嫩叶段，采样袋密封带回实验室，清水仔细冲洗，去除叶片表面污物，然后移至接种室； 

B：选取中国石蒜无菌苗刚长出的嫩叶，在超净工作台上截成1cm左右的片断，直接接种； 

(3)灭菌和接种 

将清洗干净的叶段在超净工作台上按下列顺序进行灭菌：75％乙醇中消毒30-60s→无菌水清洗2次→0.1％ HgCl2溶液中灭菌8-10min→无菌水清洗4次→无菌滤纸吸干表面水分； 

然后用解剖刀将叶段切成0.8-1.0cm的片段，接种在培养基上，以上操作过程在酒精灯火焰30cm范围内进行； 

(4)培养条件 

将接种叶片片段的培养瓶整齐摆放在培养架上，诱导阶段为暗培养，温度25±2℃； 

继代培养阶段和生根培养阶段在光照条件下培养，光照强度1000-1200lx，光照时间16小时，温度25±2℃； 

(5)继代培养 

待叶片组织分化出的白色小鳞茎达到0.5cm高度时，进行继代培养，选用继代培养培养基，转接操作在超净工作台上进行，将小鳞茎上半部切除后，转接于新的培养基上，继代培养可连续培养多代，以实现快速增殖； 

(6)生根培养