[发明专利]抗派琴虫膜蛋白的单克隆抗体、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及免疫学领域，具体地说，涉及抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体、其制备方法及应用。

背景技术

派琴虫（Perkinsus，或拍琴虫）是影响世界贝类养殖业发展的主要病原之一，由于其分布广，危害严重，被世界动物卫生组织（OIE）规定为必报水生动物疾病。1997年,我国在从菲律宾进口的蛤仔体内检测到派琴虫。2001年梁玉波等，采用巯基醋酸盐培养基(FTM)培养及组织切片的方法证明，蛤仔的派琴虫感染率为20%-100%。2008年农业部首次将派琴虫列入了主要感染蛤仔的寄生虫病原。

鉴于派琴虫危害的严重程度，国内外开展了大量的研究工作，目前，液体巯基醋酸盐培养基（FTM）方法被广泛应用于派琴虫的感染鉴定，随着分子生物学的发展，出现了利用普通PCR、荧光PCR以及LAMP检测的相关研究。但是有关派琴虫免疫学检测方面的报道相对较少。

发明内容

本发明的目的是提供抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC No.6180的抗派琴虫膜蛋白（MOE）的杂交瘤细胞株IAQ1101（即S1005）分泌产生。

本发明还提供制备上述抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体的方法:将从感染派琴虫的贝类组织中提取的总DNA作为模板，以5’-GGCTGATATCGGATCCTCCTCTTGTCCCACAGGGGATGC-3’和5’-CCGCAAGCTTGTCGACTTATGACGTAGGACATGTCGG-3’为引物进行PCR扩增，将扩增产物插入到表达载体中，并转化宿主细胞，随宿主细胞的复制进行蛋白表达，然后用纯化后的目的蛋白免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，筛选得到抗派琴虫膜蛋白（MOE）的杂交瘤细胞株IAQ1101，由其分泌产生抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体。

前述方法中，PCR扩增体系以25μL计为：

PCR扩增条件为：95℃5min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，共40个循环；72℃10min。

前述方法中，优选使用的表达载体为pET32a，宿主细胞优选为大肠杆菌BL21。

前述方法中，使用的小鼠骨髓瘤细胞为NS1、SP2/0-Ag14（简称SP2/0）或X63Ag8.653。优选使用SP2/0。

本发明还提供含有所述抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体的检测试剂盒。

本发明还提供所述抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体或所述检测试剂盒在贝类派琴虫检测中的应用：其采用免疫荧光标记的方法，先对抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体进行荧光标记，然后利用该荧光标记的抗体检测贝类组织切片或贝类组织匀浆物中感染的派琴虫。

本发明进一步提供抗派琴虫膜蛋白（MOE）的杂交瘤细胞株IAQ1101（即S1005），现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2012年6月5日，保藏号CGMCCNo.6180。

为了获得大量的抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体，使杂交瘤细胞定植于小鼠腹腔中，收获产生的大量腹水，腹水中除了含有所需的单克隆抗体外，还含有较多的杂蛋白、非特异性IgG和许多的蛋白酶，易使抗体失活，因此腹水收集后应尽快纯化，防止降解。

采用Western Blotting法鉴定纯化后的抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体。即对纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE，然后按照常规方法电转移至硝酸纤维素（NC）膜上，再进行封闭-加派琴虫单抗-显色等一系列操作。

采用间接酶联免疫法（ELISA）筛选抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体。用纯化后的派琴虫膜蛋白（MOE）（即上述目的蛋白）包被ELISA板，加入1%BSA液封闭后用PBS洗涤，然后加入含有抗派琴虫膜蛋白（MOE）的单克隆抗体的上清液（即腹水离心后收集的上清）；经过一定时间反应后，洗去未结合的抗体；再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG；以辣根过氧化物酶底物（TMB）为酶底物显色。上清液中杂交瘤分泌出的抗派琴虫膜蛋白（MOE）单抗可与派琴虫膜蛋白（MOE）结合，然后又与酶标二抗结合，使酶催化底物而显蓝色，通过酶标仪来检测结果。

另外，可辅以显微镜观察，有助于对派琴虫的感染进行定位分析。