[发明专利]从原料乳中分离β-乳球蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种β-乳球蛋白的分离纯化方法，具体地说是一种从新鲜牛乳中高效分离和纯化β-乳球蛋白的方法。

背景技术

β-乳球蛋白存在于大多数哺乳动物的乳中，是由乳腺上皮细胞合成的乳特有蛋白，在牛乳中浓度约为 3.2g/L，主要以二聚体的形式存在，2 个单体由非共价键连接。当 pH＜3.0 或pH＞7.0 时，β-乳球蛋白二聚体解离成单体。单体β-乳球蛋白分子量在 18300 道尔顿左右，等电点为5.1～5.3。β-乳球蛋白占乳清蛋白的55%左右，是乳清中的主要蛋白，是乳清蛋白的功能体现者。它具有改变牛乳热稳定性、与脂肪酸及风味物质结合、抗癌等生物学活性以及良好的搅打起泡性、凝胶性、成膜性等加工特性，被广泛应用于食品加工、化妆品、医药等领域。目前已有分离β-乳球蛋白的方法，例如亲和层析、制备色谱、透析等，但处理量较小，仪器复杂、制备成本高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种制备简易、纯度高，成本低的β-乳球蛋白。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种从原料乳中分离β-乳球蛋白的方法，包括如下步骤：

1）、将新鲜牛乳于3~5℃经离心和脱脂纱布过滤处理，从而除去乳脂肪，得首次滤液；

2）、首次滤液调节pH至4.5~4.7，室温下静置20~40min；得处理后首次滤液；

3）、将处理后首次滤液于3~5℃经离心和脱脂纱布过滤处理，所得的滤液重复上述3~5℃下的离心和脱脂纱布过滤处理，得二次滤液；

4）、二次滤液调节pH至1.9~2.1，得处理后二次滤液；

5）、先按照每1L处理后二次滤液添加65~75g氯化钠的用量比在二次滤液中加入氯化钠；然后再调节pH至1.9~2.1，接着室温下静置15~25min；

6）、将步骤5）所得物于3~5℃下经离心和脱脂纱布过滤处理，收集滤液；

7）、先按照每1L滤液（为步骤6）所得的滤液）添加220~240g氯化钠的用量比在滤液中加入氯化钠；然后再调节pH至1.9~2.1，接着室温下静置15~25min；

8）、将步骤7）的所得物于室温下离心，将所得的沉淀溶解于PBS缓冲液（pH7.4）或蒸馏水中；

备注说明：PBS缓冲液（pH7.4）或蒸馏水的用量最少要求能溶解沉淀；一般而言，1000ml的新鲜牛乳作为原料配用100 ml左右的PBS缓冲液（pH7.4）或蒸馏水。

9）、室温下，将步骤8）所得的溶液用截留分子量10000的滤膜进行超滤2~8小时；所得的截留液经冻干，得冻干β-乳球蛋白粉末。

作为本发明的从原料乳中分离β-乳球蛋白的方法的改进：

将冻干β-乳球蛋白粉末进行提纯：用C8反相键合硅胶色谱柱、以乙睛-水为流动相进行梯度洗脱；214nm波长检测，分别得A型β-乳球蛋白和B型β-乳球蛋白。

作为本发明的从原料乳中分离β-乳球蛋白的方法的进一步改进：

步骤1）为：将新鲜牛乳以3500~4500g，3~5℃，离心25~35min，4层脱脂纱布过滤；

步骤3）为：将处理后首次滤液于3~5℃，4500~5500g下离心15~25 min，4层脱脂纱布过滤；

步骤6）为：将步骤5）所得物于3~5℃，8000~12000g下离心15~25min，4层脱脂纱布过滤；

步骤8）为：将步骤7）的所得物于室温下9000~11000g 离心15~25min。

作为本发明的从原料乳中分离β-乳球蛋白的方法的进一步改进：

步骤2）、步骤4）中均用0.8~1.2 M 的盐酸调节pH值；

步骤5）和步骤7）均用1.8~2.2M的 盐酸调节pH值。

作为本发明的从原料乳中分离β-乳球蛋白的方法的进一步改进：

步骤9）中的冻干为：于-40℃~-50℃下将截留液冻干至恒重。

本发明的从原料乳中分离β-乳球蛋白的方法，是将牛乳经离心脱脂后，经过调解pH、盐析获得β-乳球蛋白溶液，用超滤脱盐浓缩后冻干，获得β-乳球蛋白冻干粉；采用高效液相色谱法检测，β-乳球蛋白冻干粉纯度大于95%。

将本发明所得的冻干β-乳球蛋白粉末从分子量角度鉴定蛋白：采用12-20%浓度十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），考马斯亮蓝染色，以标准品对照，确定目标蛋白子分子量为18.2kD。