[发明专利]一种分泌脂肪酶的毕赤酵母共表达伴侣蛋白基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产脂肪酶的毕赤酵母基因工程菌，特别是一种通过提高分泌效率加速积累脂肪酶的基因工程菌。 

背景技术

脂肪酶又称三酰基甘油水解酶（EC 3.1.1.3）是一种广泛应用的水解酶类，能够在水不溶性的底物酯和水的界面催化反应水解底物酯键。微生物脂肪酶被广泛应用于很多工业，如油脂工业、制药工业、食品工业和饲料工业等。但是，所有这些工业化应用能否成功的关键因素之一就是脂肪酶的高水平表达。本研究前期从浓香型大曲中筛选得到一株华根霉（CCTCC M201021），从中克隆得到了一段脂肪酶基因，并在毕赤酵母中成功表达。喻晓蔚等发明设计的中国专利（CN201010287790.8）公开了一种高产华根霉脂肪酶的基因工程菌和构建方法。主要通过荧光定量的技术，筛选并鉴定了含有不同拷贝数脂肪酶基因的重组菌，通过该技术华根霉脂肪酶获得了高水平表达。为了进一步满足工业化生产华根霉脂肪酶的需求和进一步挖掘毕赤酵母表达华根霉脂肪酶的潜力，本发明欲采用共表达伴侣蛋白的策略加强胞内内质网中外源蛋白的合成速率以进一步提高华根霉脂肪酶的表达水平。 

通过同源建模获得了华根霉脂肪酶的立体结构，分析表明该脂肪酶的结构中存在三对二硫键。分子伴侣能够帮助蛋白质的正确折叠或纠正蛋白质的错误折叠，降低酶蛋白因错误折叠的降解率，伴侣分子不参与蛋白质的最终组成。在酵母中二硫键形成需要内质网氧化还原蛋白Ero1p和蛋白质二硫键异构酶PDI协调作用，通过PDI来介导氧化平衡物从Ero1p传递到折叠底物，这种氧化平衡物动态穿梭能促进内质网内快速完成二硫键形成，减少或重排错误二硫键链接。通过共表达伴侣蛋白能够促进某些蛋白的表达。针对华根霉脂肪酶富含二硫键这一特征，本发明拟采用共表达两种伴侣蛋白的策略，进一步加强胞内内质网中外源蛋白的折叠速率，从而提高脂肪酶的表达量。 

分子伴侣的概念早在1978年已被Laskey等人提出，它以其能够帮助蛋白质正确折叠、降低蛋白错误折叠和提高外源蛋白表达量的能力逐渐被人关注。国内外大多数研究主要集中于添加一种伴侣蛋白如PDI等提高外源蛋白的表达量及生物活性。有学者利用基因工程手段增加内质网内分子伴侣Kar2p（结合蛋白）和蛋白质二硫键异构酶（protein disukfide isomerase，PDI）的量，使得β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母中的表达量提高了60%；Damasceno等在毕赤酵母中表达A33单链抗体（A33scFv）的同时，高效共表达免疫球重链结合蛋白质Bip，结果使 得A33scFv表达分泌量提高了两倍左右。但是上述研究均忽视了内质网中催化蛋白质氧化折叠中蛋白质的相互联系，仅共表达其中一种伴侣蛋白，而本研究正是在对内质网中Ero1p介导的氧化折叠模型细致分析的基础上，提出了共表达Ero1p和PDI两种伴侣蛋白，从而显著提高了脂肪酶的表达量。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在巴斯德毕赤酵母（P.pastoris GS115）中能够加速折叠分泌表达华根霉脂肪酶的基因工程菌法，以期运用该高产工程菌大规模的发酵生产华根霉脂肪酶。 

本发明提供的巴斯德毕赤酵母基因工程菌（Pichia pastoris）基因工程菌，于2012年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.6123。 

本发明要解决的另一个技术问题是，提供一种发酵生产脂肪酶的方法，包括如下步骤： 

1）接种所述基因工程菌到YPD培养基中，摇床30℃培养18小时左右，当种子液OD₆₀₀达2～5后，完成摇瓶种子液的制备； 

2）然后转入7L发酵罐BSM基础盐培养基进行发酵，起始装液量为2L，在30℃、pH5.5、溶氧50%～80%条件下进行甘油生长相培养； 

3）当基础培养基中甘油消耗完，溶氧值大幅度上升，然后进入过渡相，流加50%甘油（含12mL/L PTM1），使菌体浓度长至35～39g/L，停止甘油补加，饥饿0.5h，然后进入诱导相，进行甲醇，每Kg甲醇含30ml PTM1流加，温度控制于26～28℃；在甲醇诱导表达阶段，采用溶氧两段式控制策略，甲醇流加启动后，控制溶氧为初始溶氧值40%～50%，当菌体浓度达到100～110g/L，适当限制溶氧于10%～20%，整个诱导表达过程中，甲醇浓度维持于0.08～0.12%。 

共表达两种伴侣蛋白与分别共表达Ero1p或者PDI一种伴侣蛋白进行对比研究，共表达两种伴侣蛋白分别提高了2.13倍或者2倍。