[发明专利]HLA-A0201限制性抗HPV抗原特异性CTL的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术开发与应用研究领域，涉及HLA-A0201限制性抗HPV抗原特异性CTL的制备方法。

背景技术

一、HPV感染与宫颈癌

宫颈癌是全球妇女中发病率占第3位的恶性肿瘤，全球每年约有50万新发宫颈癌患者，并有将近27.4万患者死于该病。大量研究表明，宫颈癌的发生与高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持续性感染密切相关。目前已分离出100余型HPV-DNA，其中30多种与宫颈病变有关。根据其致病能力的大小分为低危型和高危型，而高危型主要导致宫颈癌的发生，以HPV16/18型多见，其编码的E6、E7癌蛋白是宫颈上皮恶性转化中的关键性蛋白。

目前针对HPV-16的VLP疫苗已经开发成功并通过FDA认可，正式投入临床使用，但对已经感染HPV和患有宫颈癌的妇女作用是甚微的。对于宫颈癌患者而言，免疫治疗的关键在于诱发有效的HPV特异CTL，从而有效抑制肿瘤的发展并清除已感染或已恶变的上皮细胞。因此构建针对HPV抗原特异性的CTL将是治疗宫颈癌的有效方法。

二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展

上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIH Rosenberg教授为首的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK）免疫疗法，并在后续研究中对LAK细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输注（3×10^10-11），另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2（IL-2）（10万IU/kg，q8h），因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用，但细胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上，1991年Stanford大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素γ（IFN-γ）、IL-2和鼠抗人CD3单克隆抗体（Mouse anti-Human CD3mAb）共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群，命名为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）。

树突状细胞（DCs）是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞（APC），其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子（MHC I类和MHCⅡ类分子），免疫共刺激分子（CD80、CD83、CD86、CD40等）。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其携带的抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异性地杀灭肿瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8（IL-8）、干扰素α（IFN-α）、白细胞介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等，增强机体非特异性免疫应答（天然免疫），故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者Ralph Steinman教授获得2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对其进行了广泛的探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基础的肿瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。

细胞毒性T淋巴细胞（CTL）构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。而研究已经证实CTL是免疫系统控制和清除HBV感染的中心环节，其反应低下或出于“exhausted”状态与感染慢性化直接相关，因此直接向患者体内回输体外扩增的功能正常的特异性CTL的过继免疫治疗可以起到清除HBV感染的细胞的作用。

三、CTL作用机理

1、机体T细胞免疫反应过程

机体存在庞大的T细胞库，通过其表面表达不同的T细胞受体（TCR）特异识别不同的外部抗原分子（细菌、病毒和肿瘤抗原多肽），被活化为具有杀灭靶细胞的CTL，清除细菌、病毒的感染和肿瘤细胞，且能产生免疫记忆性CTL，防止细菌、病毒的再次入侵和肿瘤的复发。CTL免疫应答大致分四个阶段：

（1）抗原识别：APC通过表面受体识别并捕获抗原（细菌、病毒、肿瘤细胞）；