[发明专利]一种固定化酶法连续转化生产γ-氨基丁酸的方法

权利要求书

1.一种采用固定化酶法连续转化生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于该方法包括：

以固定化重组表达的纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶融合蛋白、简称“固定化酶”为酶源，浓度为0.05mM~0.15mM的磷酸吡哆醛存在的条件下，进行酶促反应，反应过程中，向反应体系中加入固定化酶4mL/L至20mL/L，底物L-谷氨酸钠或L-谷氨酸为20g/L至50g/L，温度25至50℃，pH值为4至6，经酶法转化反应1h至4h生产γ-氨基丁酸，并进一步分离获得γ-氨基丁酸粉末或晶体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的固定化重组表达的纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶融合蛋白的制备方法是：

首先，构建高效融合表达纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶的基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，即以大肠杆菌BL21的基因组为模板进行PCR扩增谷氨酸脱羧酶基因，构建pET21(+)-GAD表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，随后将确认的GAD基因转入pET35b，获得重组表达载体pET35b-GAD，再构建基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达；

以上述重组基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-GAD的细胞裂解液为起始酶源，经过纤维素载体吸附，完成固定化，得到固定化酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的谷氨酸脱羧酶基因来源于构建的重组菌株BL21(DE3)-pET21a(+)-GAD，该菌株具备可表达谷氨酸脱羧酶融合蛋白，并能够将L-谷氨酸或其钠盐转化为γ-氨基丁酸。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述的纤维素载体包括纤维素微球、纤维素凝胶、脱脂棉和滤纸。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：固定化酶采用纤维素结合域-谷氨酸脱羧酶融合蛋白特异性吸附固定的方式，或采用交联剂进一步交联固定的方式，其中交联剂为戊二醛，浓度为0.1%。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：酶促反应优选转化温度为37℃；优选转化pH值为5.5；优选转化时间为2h；底物L-谷氨酸钠或L-谷氨酸的用量优选分别为40g/L；辅酶磷酸吡哆醛浓度为0.1mM；固定化酶优选用量为8mL/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：固定化酶源可重复使用15次以上，且在最佳的反应条件和体系下，连续转化10次，其催化底物转化率均能够达93%以上。