[发明专利]用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种临床检验用途的基因检测试剂盒，采用基因测序技术，对IL28B SNP rs12980275多态性位点进行检测，可以用于预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果。 

背景技术

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起的肝脏急慢性炎症，自从1989年被美国发现以来，HCV感染逐渐成为一个世界性公卫生问题。我国感染者约有4200万人，每年的新发病例约300-400万。80%感染者会发展成慢性肝炎，30%进展为终末期肝病，包括肝硬化、肝癌等。目前临床上主要是应用干扰素合用利巴韦林来进行丙肝的治疗，但是这种联合治疗方案，不同的病人对这种联合治疗应答的效果差异很大。 

IL28B基因编码IFN-λ3，为Ⅲ型干扰素，位于19号染色体上，包含6个外显子，属于IFN-λs家族。IFN-λ主要是通过JAK-STAT信号途径，诱导STAT1和STAT2的磷酸化,使ISGF3复合物产生，而且使2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylatesynthetase,OAS)基因家族和MxA(也称Mx1)蛋白的表达明显提高，从而其抗病毒效应才发挥出来。2009年，美国杜克大学Goldstein等研究发现，编码IFNλ3的IL28B基因附近有一些单核苷酸多态性(SNP)位点与HCV病毒自发清除能力及对干扰素的应答有关。当这些等位基因发生突变后，患者的丙肝病毒自发清除和对干扰素应答能力发生明显变化。 

近期在欧洲人群和非洲人群之间进行的针对1型丙型肝炎基因组范围相关性研究中发现，其单核苷酸多态性（SNP）位点rs12979860，rs12980275，rs8099917等的变异与病毒的清除和干扰素治疗的应答高度相关，而位于IL28B基因下游3kb位置上的rs12980275位点和治疗无应答(NVR)也密切相关。有报道指出IL28B SNP位点rs12980275基因型为AA的患者的持续病毒学应答（sustained virological response，SVR）百分比明显高于GG基因型患者。通过研究rs12980275位点的基因多态性，从而进一步完善临床对患者的丙肝病毒自发清除能力及丙型肝炎治疗效果的评估。 

目前可用SNP多态性检测的方法有限制性片段长度多态性（sscp）,基因测序，荧光定量PCR等，sscp技术相对简单，但酶切位点易受基因变异影响，影响结果判断。本发明考虑到节约成本及时间等因素，选用基因测序法检测IL28B基因多态性位点rs12980275。 

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒，可用于检测rs12980275位点是否发生突变。 

用于检测丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多态性的试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、检测体系PCR反应液,其特征在于： 

检测体系PCR反应液包括dNTP，用于PCR反应的Tag酶及其缓冲反应液、检测IL28Brs12980275多态性用上下游引物，其中， 

IL28B上游引物序列：GTAGGGGGAATCATACAGCATT 

IL28B下游引物序列：GAGAGTTCTGGAGATTGCTTGC。 

进一步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤： 

(i)采集待测血液样本，提取DNA； 

(ii)以该DNA为模板，用IL28B上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物； 

(ⅲ)对PCR反应产物测序，与IL28B正常基因序列进行比较，确定是否存在突变位点。 

优选地，步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃5min；98℃10s、58℃20s、68℃2min、40个循环。 

本发明通过设计一对与IL28B基因特异结合的引物,扩增片段包括SNP12980275序列。采用聚合酶链式反应（PCR）技术,对特定核苷酸片断进行指数扩增,并以扩增出的高浓度目的基因进行基因测序，检测IL28B SNP位点rs12980275多态性，该位点的基因型有AA，AG及GG三种。 

本发明引物通过如下的方案进行设计： 

使用Primer 6.0r软件协助设计引物，通过PCR扩增，将IL28B rs12980275多态性位点位点完全扩增，然后进行直接测序，通过测序检测rs12980275位点是否发生突变。