[发明专利]在原核系统中分离纯化包涵体形式HIV-1蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种在原核系统中分离纯化包涵体形式HIV-1蛋白酶的方法，包括如下步骤：1)将离心收集的HIV-1蛋白酶表达菌用溶液A(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl，2mM EDTA)悬浮，并加入核酸酶DNase I，使用低温超高压细胞破碎仪裂解细胞，将高压破菌仪调至1200bar，将菌液反复高压3次，然后在菌液中各加入2％TritonX-100和2％Tween20，搅拌均匀，使用超声波处理，然后离心收集沉淀；2)用溶液B(20mMTris-HCl，pH8.0，500mM NaCl，2mM EDTA，2％TritonX-100，2％Tween20)均匀重悬沉淀，直至成无块状物的包涵体悬浊液，然后将悬浊液超声处理，然后离心收集沉淀，重复操作3次；3)用溶液C(20mM Tris-HCl，pH8.0，10mM NaCl，8M Urea)彻底溶解包涵体，离心取上清，然后选用截留分子量为30kD超滤膜与Amicon搅拌式超滤装置配合使用将杂蛋白与HIV-1蛋白酶进行分离，收集30kD超滤膜下的蛋白溶液，即得纯化的HIV-1蛋白酶溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中超声功率300W，开4s，关6s，超声20min。

3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)中超声处理5min，超声功率300W，开4s，关6s。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，截留分子量为30kD超滤膜与Amicon搅拌式超滤装置配合使用的具体方法：将截留分子量为30kD圆片超滤膜与Amicon Stirred Cell超滤杯组装，将上清(最大处理量50mL)倒入超滤杯中，加盖密封，高纯氮气加压至1.2MPa，然后将整个装置放在磁力搅拌器上，收集超滤膜下蛋白溶液，当上清液浓缩至20mL时，补加溶液C继续超滤至20mL，将膜下蛋白溶液合并，以备复性。

5.根据权利要求4所述的方法，所述超滤膜优选使用前用20％乙醇浸泡处理，然后用双蒸水将乙醇清洗干净。

6.根据权利要求1所述的方法，所述方法中还包括HIV-1蛋白酶的表达步骤，具体为：将包含HIV-1蛋白酶表达质粒的重组菌，先使用SOC培养基过夜培养，然后转接到LB培养基中扩大培养至OD600为0.5，加入0.1mM的IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)进行。

7.根据权利要求6所述的方法，其中过夜培养时间为12小时，37℃培养时间为4小时，诱导表达时间为6小时。

8.根据权利要求6所述的方法，其中培养温度均为37℃。

9.根据权利要求1所述的方法，所述方法中还包括包涵体的透析复性步骤，具体为：用溶液C稀释至蛋白浓度0.1-0.5mg/mL，然后加到透析袋中，放入4℃预冷的透析缓冲液A(双蒸水，10％甘油，0.2％beta-巯基乙醇)中，透析4-5小时，然后将透析袋转转移到4℃预冷的透析缓冲液B(20MmNaAc-HAc，pH5.2，0.2％beta-巯基乙醇)中，透析4-5小时后取出透析袋中溶液，离心收集上清。

10.根据权利要求9所述的方法，所述透析复性后的上清经蛋白浓缩、分装，液氮快速冷冻后放在-80℃冰箱保存。

11.一种利用荧光共振能量转移技术测定HIV-1蛋白酶动力学的方法，该方法中使用人工多肽底物MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp，所述HIV-1蛋白酶是经权利要求1-10所述方法分离纯化的HIV-1蛋白酶。

12.一种利用荧光共振能量转移技术测定针对HIV-1蛋白酶的抑制剂的活性的方法，该方法中使用人工多肽底物MCA-gama-abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-Glu-Lys-Dnp，以及经权利要求1-10所述方法分离纯化的HIV-1蛋白酶。