[发明专利]一种共表达伴侣蛋白的米根霉脂肪酶生产菌种

说明书

技术领域

本发明涉及一种米根霉脂肪酶的生产菌株，特别是一种通过提高分泌效率加速积累脂肪酶的基因工程菌。 

背景技术

脂肪酶又称三酰基甘油水解酶（EC3.1.1.3）是一种广泛应用的水解酶类，能够在水不溶性的底物酯和水的界面催化反应水解底物酯键。微生物脂肪酶被广泛应用于很多工业，如油脂工业、制药工业、食品工业和饲料工业等。但是，所有这些工业化应用能否成功的关键因素之一就是脂肪酶的高水平表达。 

喻晓蔚等发明设计的中国专利（专利授权号:ZL201010578626），公开了一种高产米根霉脂肪酶的基因工程菌和构建方法。为了进一步满足工业化生产米根霉脂肪酶的需求和进一步挖掘毕赤酵母表达米根霉脂肪酶的潜力，本发明欲采用共表达伴侣蛋白的策略加强胞内内质网中外源蛋白的合成速率以进一步提高米根霉脂肪酶的表达水平。 

通过米根霉脂肪酶的结构中存在三对二硫键。分子伴侣能够帮助蛋白质的正确折叠或纠正蛋白质的错误折叠，降低酶蛋白因错误折叠的降解率，伴侣分子不参与蛋白质的最终组成。在酵母中二硫键形成需要内质网氧化还原蛋白Ero1p和蛋白质二硫键异构酶PDI协调作用，通过PDI来介导氧化平衡物从Ero1p传递到折叠底物，这种氧化平衡物动态穿梭能促进内质网内快速完成二硫键形成，减少或重排错误二硫键链接。通过共表达伴侣蛋白能够促进某些蛋白的表达。针对米根霉脂肪酶富含二硫键这一特征，本发明拟采用共表达两种伴侣蛋白的策略，进一步加强胞内内质网中外源蛋白的折叠速率，从而提高脂肪酶的表达量。 

分子伴侣的概念早在1978年已被Laskey等人提出，它以其能够帮助蛋白质正确折叠、降低蛋白错误折叠和提高外源蛋白表达量的能力逐渐被人关注。国内外大多数研究主要集中于添加一种伴侣蛋白如PDI等提高外源蛋白的表达量及生物活性。有学者利用基因工程手段增加内质网内分子伴侣Kar2p（结合蛋白）和蛋白质二硫键异构酶（protein disukfide isomerase，PDI）的量，使得β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母中的表达量提高了60%；Damasceno等在毕赤酵母中表达A33单链抗体（A33scFv）的同时，高效共表达免疫球重链结合蛋白质Bip，结果使得A33scFv表达分泌量提高了两倍左右。但是上述研究均忽视了内质网中催化蛋白质氧化折叠中蛋白质的相互联系，仅共表达其中一种伴侣蛋白，而本研究正是在对内质网中Ero1p介导的氧化折叠模型细致分析的基础上，提出了共表达Ero1p和PDI两种伴侣蛋白，从而显著提高了脂肪酶的表达量。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在毕赤酵母（P.pastoris GS115）中能够加速折叠分泌表达米根霉脂肪酶的基因工程菌法，以期运用该高产工程菌大规模的发酵生产米根霉脂肪酶。 

本发明提供的巴斯德毕赤酵母基因工程菌（Pichia pastoris），于2012年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.6124。 

脂肪酶的活性测定方法： 

橄榄油指示剂滴定法【参考国家标准GBT23535-2009脂肪酶制剂】 

酶活：在40℃、pH8.0条件下，1min水解底物产生1μmol可滴定脂肪酸所需要的酶量（U/mL）。 

共表达两种伴侣蛋白与分别共表达Ero1p或者PDI一种伴侣蛋白进行对比研究，非共表达伴侣蛋白的基因工程菌原始酶活为7062.5U/mL；共表达伴侣蛋白Ero1p的基因工程菌酶活为8500U/mL；共表达伴侣蛋白PDI的基因工程菌酶活为9000U/mL;共表达两种伴侣蛋白PDI和Ero1p的基因工程菌酶活为16000U/mL。可见共表达两种伴侣蛋白显著提高了米根霉脂肪酶的活性。 

本发明是利用毕赤酵母真核表达系统来生产米根霉脂肪酶，其表达量极高并可分泌到胞外。本发明的脂肪酶高产菌株的产量达到16000U/mL，远远高于国内外报道的米根霉脂肪酶的产量。并且国内外尚无报道利用伴侣蛋白ERO1p和PDI两者的协同作用提高外源蛋白在毕赤酵母GS115中的表达水平。 

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。 

材料及试剂：