[发明专利]加速黄柄鹅膏菌丝体生长的优化培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种加速黄柄鹅膏（Amanita flavipes）菌丝体生长的培养方法，属于生物技术领域，具体地说是属于大型真菌室内培养范畴。

背景技术

鹅膏菌属（Amanita）隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、鹅膏菌科（Amanitaceae），是有毒的大型真菌中较特殊、较有价值的一个世界性广布大属，其物种多样性是非常丰富的，全球已报道近400种，中国已记录的近100种（含亚种、变种及变型）。鹅膏菌属中的大部份种属于著名剧毒菌，因此，鹅膏的价值在于其毒素。鹅膏菌毒素可分为四类，其中最主要也是最重要的是肽类毒素，肽类毒素又包括鹅膏毒肽（amatoxins）、鬼笔毒肽（phallotoxins）和毒伞素类（virotoxins）三种。鹅膏毒素的应用研究主要体现在以下几方面：①可用于研究真核生物基因的表达、调控及细胞定位；②可开发抗菌、抗病毒、抗肿瘤、镇静麻醉及其它特效新药；③可用于生物防冶。

鹅膏菌属大多属于外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培，难以开发利用。虽然已有少数的种能进行菌丝的纯培养，但也存在一些问题，如菌丝生长缓慢、菌丝中毒素含量不高。鹅膏多肽毒素是一种由7-8个被修饰了的稀有氨基酸组成的环肽,可能不是基因编码的直接产物,而是经过加工后的次级产物, 要克隆毒素的基因是复杂而困难的，且其化学合成品也没有活性。因此，至今国内外还没有一种能规模化开发的毒素产品。现作为生化试剂的肽类毒素全部来源于欧美的毒鹅膏(Amanita phalloides)子实体，销价昂贵。

鹅膏种群小，个体少，产量低，分布数量极其有限。加之对生境敏感，一旦生境受到破坏，极易消失或灭绝，属于特殊的致危生物类群，这更增加了其进一步被研究、利用的难度。

鹅膏的人工驯化或栽培是保证鹅膏资源可持续性利用的前提或关键，但此目前仍然属于难以攻克的问题及盲点，其中菌丝难以诱导，菌丝生长非常缓慢是制约及影响人工培养的重要环节或因素。

黄柄鹅膏菌(Amanita flavipes Imai) 是鹅膏属中的一个广布种，主要分布于云南、四川、西藏（东南部林区），其形态特征如下：子实体较小或中等；菌盖直径3-7.5cm，初期卵圆形，后扁平至近平展，褐色到黄褐色，中央色深而向边缘色浅呈黄色，表面湿时粘附有暗黄或金黄色块状粉质鳞片；菌肉白色，近表皮下褐黄色；菌褶白色带黄色，离生，不等长，较密；菌柄较长，柱形，向下渐粗，长7-10cm，粗0.6-1cm，淡黄且上部白色带黄色，基部呈球形且有环带状金黄色斑纹或粉末状菌托残痕，内部松软至空心；菌环膜质，黄色，生柄之中上部，上表面有细条纹；孢子形状从宽椭圆形至近卵圆形，光滑，无色，7.5-10μm×5-7.5μm，糊性反应。 本发明以云南武定狮子山自然保护区采集的黄柄鹅膏菌为材料，成功分离到了该种的菌丝，但菌丝生长非常慢，难以扩繁，本发明征对此问题进行了重点突破。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种简单，生产成本低，能促进菌丝快速生长的固体培养方法。

本发明的技术方案，其步骤为：

 （1）材料的选择：野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；

（2）材料的消毒及处理：将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0.08～0.16cm²的小块；

（3）菌丝体诱导：将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基（马铃薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、NH₄NO₃ 0.30～0.40g/L、谷氨酸 0.28～0.32 g/L、V_B1 0.10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、琼脂11.00g/L，控制PH值为5.4左右）表面，培养温度为21～22℃，暗培养14～18天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，53～60天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；

（4）菌丝体均一性与扩大培养：将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿( 诱导培养基)，在温度为21～22℃下，经过38～40天的暗培养，培养皿中形成直径2.5～3.0cm的圆形规则菌落，用直径1.0 cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每35～36天扩大培养一次；