[发明专利]一种同时检测吡虫啉和甲基对硫磷的双特异单克隆抗体

说明书

(一)技术领域

本发明涉及应用于同时检测吡虫啉和甲基对硫磷双特异性单克隆抗体及制备方法，属于生物技术领域。专用于农产品和农业生产环境中吡虫啉、甲基对硫磷残留的灵敏、快速检测，特别适用于大批量样品检测。 

(二)背景技术

吡虫啉(imidacloprid，1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺)和甲基对硫磷(Parathion-methyl，O，O-二甲基-O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯)是农业生产中被广泛使用的杀虫剂，吡虫啉属于中等毒性新型烟碱类杀虫剂，而甲基对硫磷属于高毒有机磷酸酯类杀虫剂。目前，对这两种农药在农产品中的残留检测采用的是气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)；对这两种农药残留免疫分析方法也有相关报道，但同时针对这两种农药的免疫多残留检测方法却仍未见报道。 

农药多残留免疫分析技术主要有以下三种：1.将多种半抗原偶联到一个载体蛋白上，免疫动物获得抗血清进行农药多残留分析；2.提取一系列农药的公共结构，设计出通用半抗原，免疫动物获得单克隆抗体用于农药多残留分析；3.双特异性抗体法。第一种方法因只能够得到多克隆抗体而使其在生产上受到一定局限；第二种方法所制备的单克隆抗体只能够识别一类农药，对于不同种类的农药并不能同时检测；而双特异性抗体很好地解决了这个问题，双特异性抗体因其具有两个不同的抗原结合位点，而达到同时检测不同种类农药的目的。 

制备双特异性抗体主要有以下三种方法：化学交联法、杂交-杂交瘤技术和基因工程抗体技术。本发明利用甲基对硫磷杂交瘤细胞与受吡虫啉免疫原免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合的技术，制备出分泌同时抗吡虫啉-甲基对硫磷单克隆抗体的三体杂交瘤细胞。 

(三)发明内容

技术问题本发明的目的是提供一种可用于同时检测甲基对硫磷和吡虫啉农药残留的双特异性单克隆抗体及其制备方法。通过将分泌抗甲基对硫磷单克隆抗体的杂交瘤细胞与受吡虫啉免疫原免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合的策略来制备能分泌抗甲基对硫磷-吡虫啉双特异抗体的三体杂交瘤细胞。 

技术方案 

1.抗甲基对硫磷和吡虫啉双特异性单克隆抗体，是由三体杂交瘤细胞株FQ-D6产生的，为IgG2b-IgG1型，抗体轻链为kappa链。 

2.抗甲基对硫磷和吡虫啉双特异性单克隆抗体的制备方法，包括： 

(1)分泌抗甲基对硫磷单克隆抗体的HGPRT酶缺陷型杂交瘤细胞株筛选 

将分泌抗甲基对硫磷抗体的杂交瘤细胞株置于5ug/ml8-AG培养基中培养，在培养过程中逐渐提高培养基中8-AG浓度，最终使细胞株能适应在50ug/ml的8-AG的培养基中生长；之后利用HAT选择性DMEM培养基进行筛选，通过细胞是否存活来鉴别细胞中的酶是否缺失，缺失条件下进行克隆并扩大培养，并将细胞冻存备用。 

(2)受吡虫啉免疫原免疫BALB/C小鼠脾细胞的准备 

将受吡虫啉免疫原5免，血清效价达到1∶32000以上的BALB/C小鼠加强免疫3天后，眼眶取血并制备血清，作为三体杂交瘤细胞筛选时的阳性对照；将放血后的小鼠拉颈脱臼处死，并处于75％酒精体表消毒10分钟，随后移入超净工作台内，放置于无菌培养皿内，左侧腹部朝上；利用无菌手术镊和眼科剪取出小鼠脾脏，用DMEM基础培养基轻轻洗涤，尽可能剥去脾脏周围的脂肪和结缔组织；将脾脏置于120目的尼龙滤袋内，并放入另一个盛有DMEM基础培养液的培养皿中；将尼龙滤袋中的脾脏扎破并不断挤压，使脾细胞完全释放到DMEM基础培养液中；将脾细胞悬液转移到50ml离心管中，1000rpm离心10分子，弃上清，将沉淀用约30mlDMEM培养液再洗一次后悬浮，备用 

(3)细胞融合 

将脾细胞与生长状态良好的分泌抗甲基对硫磷抗体的HGPRT酶缺陷型杂交瘤细胞株通过杂交-杂交瘤技术制备三体杂交瘤细胞。并于37℃，体积比5％二氧化碳培养箱培养，待7天后通过非竞争ELISA检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞。 

(4)三体杂交瘤细胞的筛选 

对融合孔细胞上清采用间接非竞争ELISA法进行初步筛选，方法为： 

用碳酸盐包被缓冲液分别稀释甲基对硫磷及吡虫啉包被原，96孔酶标板中每孔加入50ul，于4℃下孵育过夜，将酶标板中包被液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤3次；将明胶用超纯水配置成1％的封闭液，96孔酶标板中每孔加入200ul，37℃孵育1.5小时，将酶标板中封闭液倒尽，并用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液洗涤5次