[发明专利]金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒及其制备方法和应用

说明书

技术领域：

本发明属于免疫学领域，涉及快速检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C三型残留的试剂盒和方法。 

背景技术：

金黄色葡萄球菌引起的食物中毒，主要是由于该类菌在生长繁殖过程中分泌到胞外的肠毒素引起，致病力的强弱也取决于其产生毒素的多少。金黄色葡萄球菌肠毒素可以导致以呕吐、腹泻为主要症状的食物中毒，据统计，在美国由金葡菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌食物中毒的33%，加拿大占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。因此，由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒已经成为一个世界性卫生问题。另一方面，肠毒素在由金黄色葡萄球菌引起的化脓性感染中也起重要作用，严重时可导致多器官功能障碍，危及人类生命。由此可见，食品中的致病微生物及其毒素给人类健康和生命安全带来了严重的危害。 

已知的葡萄球菌肠毒素有7个血清型，命名为SEA、SEB、SEC1-3、SED和SEE，其中以SEA最为常见，约占75%。对于加工食品来讲，热处理可破坏葡萄球菌，但毒素耐热性强，100℃持续30min仍具有活性，在一般烹调温度下，食物中如有肠毒素存在，仍能引起食物中毒；加工过程中的机械损伤也会对食品中的微生物造成影响，但对毒素没有影响。因此，建立食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的快速检测方法，研制直接检测食品中肠毒素的快速产品，对保障食品安全、保障人民生命健康均具有重大现实意义。 

我国国家标准GB/T4789.10-2003中规定的肠毒素检测方法繁琐，检测耗时，在实际工作中应用局限性大。目前，我国金葡肠毒素的检测多采用生物梅里埃VIDAS仪器，检测费用昂贵，使检测监管机构都面临巨大的检测压力，而企业更是无法承受。导致这一现状的根本原因在于国内缺乏肠毒素检测试剂产品的商品化供应。因此，该项目的研究任务迫切。 

免疫层析测试技术是九十年代初发展起来的一项新技术，因其简便（不需要任何设备）、快速、直观、敏感、特异，在临床诊断等诸多领域已得到广泛应用，用于快速检测血清或尿样中的抗原成分；也可用于检测样品中的致病菌和其它有害成分等。该方法灵敏度高和特异性强，反应快速，操作简便，不需任何特殊仪器设备，适用于 快速筛查和现场检测。本项目通过研制金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C型胶体金免疫层析检测试剂盒，可以真正实现对金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C型的快速筛查和现场检测，可以满足检验检疫一线的检测需求，为提高我国在该领域的监测水平以及保障食品安全提供了有力的技术支撑。 

发明内容：

本发明解决的技术问题是提供食品中金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒及其制备方法和应用；发明主要目的在于克服传统的检测方法繁琐，检测耗时，在实际工作中应用局限性大等缺陷，而提供一种更加快速、简捷、安全的检测试剂盒及其检测方法。 

食品中金黄色葡萄球菌肠毒素检测试剂盒，包括塑料卡盒和试纸条，所述试纸条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次搭接黏贴在底衬上组成。金标抗体结合垫上包被胶体金颗粒标记的金黄色葡萄球菌A、B或C三型多克隆抗体，硝酸纤维素膜上有包被与金标抗体形成有效夹心的单克隆抗体检测线和包被羊抗兔多克隆抗体的控制线。 

所述试纸条外部设置为塑料卡盒，塑料卡盒为三联板，从左到右依次为SEA、SEB、SEC并在联板上端对应位置做上标识，每一板上依次设置凹孔和观测口； 

所述试纸条的样品垫放置于凹孔对应处，硝酸纤维素膜上设置的控制线和检测线在观测口对应处； 

底衬为PVC； 

结合垫上包被胶体金颗粒粒径为25nm，1mL胶体金颗粒标记金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C三型多克隆抗体，标记量分别为10μg/mL、8μg/mL、15μg/mL，形成的胶体金-抗体复合物经相应浓缩后在结合点垫上进行包被，包被量为2mL/30cm。 

所述硝酸纤维素膜上检测线包被A、B、C三型相对应的多克隆抗体，浓度分别为1mg/mL、0.95mg/mL、1.1mg/mL，包被量为1μL/cm； 

控制线上包被羊抗兔抗体浓度为1mg/mL，包被量为1μL/cm。一种制备金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒的方法为： 

1、金标抗体结合垫的制备 

a.空白胶体金溶液的制备： 

采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在三角烧瓶中加入97.5mL双蒸水和1mL1%氯金酸加热至沸腾，加入浓度为1%的柠檬酸三钠溶液1.5mL，继续煮沸至液体呈现桔红色，保持沸腾状态10min后将烧瓶置于室温，充分冷却后，冷藏保存； 

b.胶体金标记抗体的制备：