[发明专利]一种制备鸡痘病毒抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒抗体的制备方法，特别涉及一种鸡痘病毒抗体的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

鸡痘在家禽业中是一种重要的疾病，严重危害家禽业的发展，引起鸡增生性皮肤损伤（喉管、气管）、咳嗽和死亡。尽管预防用的疫苗已经上市，有效地减少了该病的发生和流行，但病毒的控制以及检测仍需要特异性强、灵敏度高、快速的检测手段，因为鸡痘病毒抗原的多样性和复杂性，以抗血清为主的检测、诊断技术方法不能满足鸡痘诊断、疫苗检验的需要。

鸡痘抗原检测、疾病诊断有许多方法，传统的血清学方法一直沿用至今，也就是采用免疫血清进行免疫学试验，但是该方法存在检测效果差，灵敏度低等缺点。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明提出了一种鸡痘病毒抗体的制备方法，使用本发明方法制备得到抗体可以实现对感染动物的快速检测，其灵敏度高。本发明方法不仅适用于鸡痘病毒，也适用于其他病毒。

本发明的一种鸡痘病毒抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）鸡痘病毒的培养和粗制抗原的制备；

（2）粗制抗原的浓缩和纯化；

（3）动物免疫及抗血清的制备：使用步骤（1）得到的粗制抗原制成初次免疫原进行初步免疫后，使用步骤（2）得到的纯化抗原制成再次免疫原对动物进行再次免疫，分离得到抗血清；

（4）抗体的纯化：抗体的纯化包括抗体的初步纯化和抗体的亲和层析纯化；

所述的初步纯化是指抗血清中加入饱和硫酸铵，用膜封口冰上放置3-5h后，4℃离心，将上清移入到干净的离心管中，然后用12~14kD的透析袋或管4℃过夜透析；

所述的亲和层析纯化是将初步纯化后的抗体与结合缓冲液充分混合，置4℃摇床平衡过夜后，加入到Sepharose4B层析柱上进行层析分离，用3倍体积的结合缓冲液充分洗涤后，再用10ml洗脱液洗脱收集；

所述的结合缓冲液为75mM Tris，pH7.5；

所述的洗脱液为0.1M甘氨酸溶液，pH2.7;

（5）纯化后的收集液立即加入pH8.8且含有5MNaCl的3M Tris缓冲液中，调节pH至6.8~7.0。

在本发明中，优选的，步骤（1）中所述的粗制抗原的制备包括以下步骤：鸡胚成纤维细胞长成单层后感染接种鸡痘病毒4~5天后消化细胞，4℃以1500g离心10min，收取沉淀，用等渗缓冲液洗涤后，用含0.025%巯基乙醇、0.1%Triton-X100的低渗缓冲液溶解稀释病毒，4℃以200g离心5min，去除细胞残片和DNA，即得；

其中，所述的等渗缓冲液为含有10mM NaCl，5mM EDTA的10mM Tris缓冲液，pH8.0；

其中，所述的低渗缓冲液为含有10mM KCl，5mM EDTA的10mM Tris缓冲液，pH8.0。

在本发明中，优选的，步骤（2）中所述的抗原的浓缩是采用0.5~0.75μm膜盒式滤器或0.5~0.75μm中空纤维柱进行浓缩。

在本发明中，优选的，步骤（2）中所述的抗原的纯化是采用密度梯度离心、Sepharose4Fast Flow或Sepharose6Fast Flow层析进行纯化。

在本发明中，优选的，步骤（3）中初次免疫原的制备采用粗制抗原10mg/ml+弗氏完全佐剂，按体积比为1:1制成，再次免疫抗原采用纯化抗原1mg/ml+弗氏不完全佐剂，按体积比为1:1乳化而成。

在本发明中，优选的，步骤（4）中所述的初步纯化是指抗血清中加入饱和硫酸铵至终浓度50%，用膜封口冰上放置4h后，4℃以10000rpm离心30min，将上清移入到干净的离心管中，然后用12~14kD的透析袋或管4℃过夜透析，透析液体积应为抗体溶液体积的1000~1500倍。

在本发明中，优选的，步骤（4）中偶联了病毒抗原的CNBr活化的介质Sepharose4B是按照以下方法制备得到的：称取1~2g CNBr活化的介质Sepharose4B，用250~500ml的1mM HCl洗涤、膨胀介质30min后，用10倍体积蒸馏水洗涤3次，用5~10ml的结合缓冲液洗涤后转入病毒抗原进行偶联，偶联条件为1ml介质结合2mg纯化病毒，加入0.1%的SDS进行变性后4℃过夜，用结合缓冲液洗去未结合抗原，pH8.0，0.2M甘氨酸液4℃封闭18h，用pH 8.5结合缓冲液洗涤1次，用醋酸缓冲液洗涤4次，用于纯化抗体或加入1M NaCl在2~8℃备用。