[发明专利]一种生物法合成异戊烯醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及异戊烯醇化合物的生物合成，具体地涉及一种重组大肠杆菌工程菌株、该菌株的制备方法以及利用该重组大肠杆菌工程菌株合成异戊烯醇化合物的方法。 

背景技术

异戊烯醇又名3-甲基-2-丁烯-1-醇(3-Methyl-2-butene-1-ol)，相对分子质量为86.13，密度0.848g/CB，沸点140℃，闪点43℃，为无色透明液体，在水中的溶解度为170g/L(20℃)。异戊烯醇主要用于合成高效低毒农药拟除虫菊酯类杀虫剂的中间体贲亭酸酯(以甲酯、乙酯为主)，以及其下游产品二氯菊酸酯、DV菊酰氯(二氯菊氯)等，另外还可作为合成香料的中间体。目前的三种合成路线各有优缺点：(1)以异丁烯为原料的方法，反应在高温高压下进行，条件苛刻，且设备投资较大；(2)以异戊二烯为原料的方法，氯化氢参与反应，反应相对较为容易，但对设备腐蚀性较大，而且存在反应物醋酸钠分离困难的问题；(3)以丙酮为原料的方法源于乙炔化工，原料成本高于石油化工，由于我国是乙炔大国，故本法较适合国情。但此法须在贵金属催化剂存在的情况下进行催化加氢，使得反应操作复杂，成本升高。 

为异戊烯醇的生产提供更有效更绿色的方法将是本技术领域的进步。一种有可能的解决方法是利用生物合成途径来生产异戊烯。工程大肠杆菌具有生长速度快、发酵周期短、遗传背景清楚、易于工程化操作、可利用廉价的可再生资源等特点，因此工程大肠杆菌作为生物催化剂已成为近年来生产生物基化学品的有效手段。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而再利用MVA途径的终产物二甲基丙烯基焦磷酸作为直接前体来转化生产异戊二烯(美国专利公开，2009/0203102)。MVA途径首先在甲基戊二酰辅酶A合成酶和羟甲基戊二 酰辅酶A还原酶的作用下利用糖来合成甲羟戊酸，然后甲羟戊酸再在甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的作用下转化为异戊烯基焦磷酸(IPP)，IPP再在异戊烯基焦磷酸异构酶的作用下转化为二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)。 

高特异性生产异戊烯醇可以简化产物分离，从而有效节约生产成本和生产周期，无疑将会产生重要的经济效益。为了高特异性生产异戊烯醇，需要找到一种能够高特异性水解DMAPP的焦磷酸酶，但是目前尚没有关于焦磷酸酶底物特异性研究的报道，缺少一种能够高特异性水解DMAPP的焦磷酸酶。Wither等鉴定了一种来源于枯草芽孢杆菌的焦磷酸酶基因，并通过体内和体外反应进行了其功能，发现其能够水解IPP和DMAPP生成异戊烯醇和异戊二烯醇(Wither et al，2007)，但没有对其底物特异性进行研究，也没有对异戊烯醇和异戊二烯醇生产途径进行优化。 

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明主要通过代谢工程改造甲羟戊酸途径(MVA途径)，特别是过量表达来源于大肠杆菌的焦磷酸酶，从而在工程大肠杆菌中实现了高特异性生产产物组成超过80％以上的异戊烯醇。 

因此，在第一个方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌菌株，其包含： 

(1)编码羟甲基戊二酰辅酶A合成酶的基因片段和编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因片段或分别与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70％以上同源性的核酸分子； 

(2)编码甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶的基因片段或分别与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶和异戊烯基焦磷酸异构酶基因具有70％以上同源性的核酸分子； 

(3)编码焦磷酸酶的基因片段，或与焦磷酸酶基因具有70％以上同源性的核酸分子，或与焦磷酸酶基因无明显同源性但其表达产物能够水解异戊烯基焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸且对二甲基丙烯基焦磷酸具有明显底物偏爱性的核酸分子。 

在第二个方面，本发明提供了一种制备重组大肠杆菌菌株的方法，该方法包括以下步骤： 

(1)制备包含羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因具有70％以上同源性的核酸序列的重组质粒A； 

(2)将重组质粒A与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因片段或与羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因具有70％以上同源性的核酸序列连接成重组质粒B；