[发明专利]肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体而言，涉及协同抗肿瘤作用和蛋白稳定性的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域（trimerization domain，TD）的融合蛋白，和融合蛋白包含体的复性、纯化方法。

技术背景

肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）是继TNF、FasL之后发现的第三个TNF家族的凋亡因子，为一种抗癌应用前景良好的生物药物。TRAIL由Wiley等从心肌cDNA文库中克隆出来的，因其氨基酸顺序具有TNF超家族的结构特征并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类淋巴细胞凋亡而得名。许多临床前期研究表明TRAIL能有效诱导多种癌细胞系凋亡，并同时保护正常细胞免于细胞毒副反应。目前国外已进行关于TRAIL及其受体激动型抗体的Ⅰ、Ⅱ期临床试验，并取得初步疗效。另外，TRAIL对NF-κB仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像TNF-α和Fas-L那样产生严重的炎症反应，这些特性使得TRAIL有成为新一代抗肿瘤药物的潜质。

TRAIL又称凋亡素-2 配体（Apo-2L），属于TNF家族成员。TRAIL基因定位于染色体3q26，编码281个氨基酸，属于Ⅱ型跨膜蛋白，N端无信号肽序列，第15-40位氨基酸形成疏水跨膜结构，胞内区非常短，C端胞外区为保守性强的114-281位氨基酸，形成典型的β折叠，为其与受体结合的部位。TRAIL分子量为32.5kD，等电点7.63，广泛表达于包括脾、淋巴结、肺、前列腺以及外周淋巴细胞等在内的大多数正常组织，但不表达于脑组织及睾丸中。研究证实TRAIL与死亡受体结合后能诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对绝大多数正常细胞无毒副作用，同时发现激活的T细胞、NK细胞、单核细胞以及树突状细胞表达TRAIL，提示它在宿主防御和维持免疫稳态方面起作用，参与免疫调节。

Sarah G.Hymowitz等研究发现TRAIL在形成三聚体时生物活性最强，同时受体激活时也成三聚体形式，三聚体顶部附近的锌结合位点对维持TRAIL的结构与稳定性起到重要作用，离体实验表明，全长或可溶形式的TRAIL形成的三聚体都可以快速诱导多种肿瘤细胞凋亡。TRAIL分子中还存在一些特殊位点，第109位的天冬氨酸（Asp）是一个潜在的N糖基化位点，可被金属蛋白酶从膜上切下而产生一相对分子质量为24000左右的可溶性活性肽段（114-281），该片段可形成分子量分别为48 000和66 000左右的二聚体和三聚体，TRAIL的药物应用多采用此肽段。TRAIL与TNF家族其它成员最独特的区别在于其第137-152位氨基酸序列可形成一个由12-16个氨基酸组成的凸出的环（AA loop）,此结构可插入受体的TRAIL结合位点，从而保证受体与TRAIL特异性结合，研究表明，此插入环与TRAIL细胞毒性作用有关。另外，TRAIL序列中Cys230残基在维持TRAIL的结构和生物活性中具有重要作用。若Cys230突变为Ala或Ser，TRAIL蛋白的稳定性下降，而且不能螯合锌原子形成三聚体，与受体结合能力也会下降200倍，严重影响TRAIL的诱导凋亡的活性。

然而有研究表明高度聚合的重组TRAIL（如His-TRAIL，交联的FLAG-TRAIL）对体外培养一天的原代人肝细胞（PHH）有毒。未标记的Apo2L.0/TRAIL.0对人星形胶质细胞无毒，而经标记的类型如LZ-TRAIL、交联FLAG-TRAIL和His-TRAIL能诱导分离的成熟星形胶质细胞和培养的成熟脑部切片组织凋亡。LZ-TRAIL和His-TRAIL对增殖的原代人角化细胞有明显毒性，而未标记TRAIL毒性较弱。因此，重组TRAIL的类型决定了高秩序复合物的形成，聚合程度则在提高TRAIL效用的同时导致了对其他正常细胞的毒性。研究者认为His 、FLAG、LZ和IZ等标签由于并非一个独立域（domain），在融合表达蛋白质（如TRAIL）时，会有可能由于融合蛋白整体氨基酸序列的改变导致融合蛋白三级结构的改变，进而引进未知的毒性。