[发明专利]一种基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法

说明书

技术领域

本发明涉及将微流控芯片技术应用到实时监测的细胞生物学研究的技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法。

背景技术

细胞生物学发展至今，主要的培养和研究依赖于是孔板和商品化的transwell小室，集中观察单一或者多种因素刺激下细胞形态变化、生长过程、迁移和增值行为等。而在众多的细胞行为研究中，细胞迁移作为生物体发育和形态建成等重要生命过程的基础，而备受关注。细胞迁移一般起始于细胞对其微环境刺激的感应，微环境刺激通过细胞表面受体激活一系列的胞内信号转导通路与基因转录，并进而通过细胞极性的改变、细胞的粘附及去粘附、细胞骨架的重排等多个环节，最终完成细胞形态和位置的改变。对于肿瘤细胞而言，其迁移过程与肿瘤转移密切相关，肿瘤转移是一个多步骤连续性很强的主动过程，可分为以下几个步骤，即局部浸润、渗入血管、随血液循环系统转移并在其中存活、肿瘤细胞外渗移出血管、在新的部位定居并增殖。肿瘤细胞迁移涉及到肿瘤细胞从二维的血管微环境进入周围三维微组织的过程，也是肿瘤转移发生过程决速步的过程。孔板或者transwell小室很难在体外构建二维平面到三维空间的界面转换，所以想模拟和重现上述肿瘤细胞迁移过程是比较困难的。

微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。它对于实验结果能够实时追踪，不仅能够获得最终结果，也可以得到细胞迁移过程中出现的暂时性信息，为肿瘤细胞迁移过程提供常规分析中有可能缺失的重要生物学信息。而目前，利用微流控芯片进行肿瘤细胞迁移动力学过程监测，尤其是肿瘤细胞从二维平面迁移运动到三维基质过程的研究分析还处于空白阶段。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，特别针对肿瘤细胞从二维平面迁移运动到三维基质中的过程，该方法具有对细胞运动实时追踪的特点，同时能够实现对细胞运动之初的准确定位。

本发明提供了一种微流控芯片，该微流控芯片主要由细胞入口池（1），胶原入口池（2），废液池（3），细胞培养室（4），细胞迁移室（5）组成；细胞培养室（5）上连细胞入口池（1），细胞培养室（5）下连废液池（3），一个细胞培养室横向与三个细胞迁移室相连。

本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上层材料为可透光透气的PDMS聚合物，下层材料为浓硫酸煮过的洁净玻璃。

本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片的上下两层分别进行紫外过夜照射的灭菌处理，然后等离子体处理30-45s进行封接。

本发明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的两部分组成（1）、（3）、（4）高度约为（2）和（5）高度的三倍；其中，（1）、（3）、（4）高度为210μm，（2）和（5）高度为70μm。

本发明还提供了一种基于所述的微流控芯片的肿瘤细胞迁移动力学监测方法，方法过程如下：

（1）芯片胶原灌注

用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原入口池，每孔0.4μL；加1mLPBS缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min，促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶过程结束后，从细胞入口池、胶原入口池分别顺序加入新鲜的细胞培养液；

（2）芯片细胞接种及培养

细胞消化后，调整细胞密度为1×10⁶/mL，取10μL细胞悬液加入细胞入口池，并迅速从废液池吸走0.5μL细胞培养液，促使细胞在重力流的作用下快速、均匀地进入细胞培养室；当在光学显微镜下观察到已经有部分细胞流入废液池，而细胞培养室中的细胞也均匀分布时，立即将芯片竖立，并移入37℃培养箱中放置。竖立方向为细胞培养室朝上，而细胞迁移室朝下；竖立放置10min后，取出观察，如果细胞紧贴在细胞培养室与迁移室的交汇处，说明细胞接种比较成功；将芯片放平移入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次，并拍照记录肿瘤细胞所在位置；

(3)芯片细胞迁移实时监测