[发明专利]一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种转基因香石竹Moonshade的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤：

1）转基因香石竹Moonshade基因组DNA的提取；

2）转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列的分离和确认：利用LM-PCR方法分离得到包括如SEQ ID No1所示的194bp未知序列和130bp的外源插入载体序列；根据该未知序列设计引物GenomeC1F/GenomeC1R进行PCR扩增，PCR扩增结果证明如SEQ ID No1所示的序列为香石竹基因组序列，即转基因香石竹Moonshade外源基因插入位点的左边界旁邻序列如SEQ ID No1所示；

3）转基因香石竹Moonshade的定性PCR检测：采用Moonshade品系特异性定性引物对shadeC1F/shadeC1R进行定性PCR扩增；

4）转基因香石竹Moonshade的定量PCR检测：由转基因香石竹Moonshade基因组DNA作为标准品，采用Moonshade品系特异性定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe进行定量PCR扩增，同时，采用内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2序列和探针ANS-Probe进行内标准基因定量PCR，并建立品系特异性定量标准曲线和内标准基因ans的定量标准曲线；再利用相对定量法对样品进行定量检测；

其中，引物GenomeC1F/GenomeC1R，其序列分别如SEQ ID No2和SEQ ID No3所示；引物对shadeC1F/shadeC1R序列分别如SEQ ID No4和SEQ ID No5所示；定量引物对shadeR1F/shadeR1R和探针shade-Probe序列分别如SEQ ID No6、SEQ ID No7和SEQ ID No8所示；内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2序列和探针ANS-Probe序列如SEQ ID No9、SEQ ID No10和SEQ ID No11所示。

2.根据权利要求1所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述LM-PCR方法的扩增反应体系为：第1轮扩增反应：总体积30μL，3μL1×PCR缓冲液，3μL2mM dNTPs，1μL10μM引物C1，1μL10μM引物MP1，0.3μL5U LA-Taq DNA聚合酶，2μL Moonshade DNA，19.7μL双蒸水；第2轮反应：总体积30μL，3μL 1×PCR缓冲液，3μL 2mM dNTPs，1μL 10μM引物MP2，1μL10μM引物C2，0.3μL5U Taq DNA聚合酶，19.7μL双蒸水和2μL(25ng/μL)第一轮PCR产物；其中，引物C1的序列如SEQ ID No12所示，引物MP1的序列如SEQ ID No13所示，引物C2的序列如SEQ ID No14所示，引物MP2的序列如SEQ ID No15所示。

3.根据权利要求1所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述定性PCR检测的反应体系为：总体积25μL，5μL Moonshade DNA，2.5μL1×PCR缓冲液,2.5μL2mM dNTPs，12.7μL双蒸水，10μM定性引物对shadeC1F/shadeC1R各1μL和0.3μL5U Taq DNA聚合酶；反应程序：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35个循环；72℃，7min。

4.根据权利要求1所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述定量PCR检测的反应体系为：总体积25μL，2.5μL1×PCR缓冲液，2.5μL2mM dNTPs，5μL25mM MgCl₂，10μM定量引物对shadeR1F/shadeR1R各0.5μL，1.0μL10μM探针shade-Probe，0.25μL5U Taq DNA聚合酶，5μL DNA和7.75μL双蒸水；反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，30s，60℃，45s，72℃，45S，45个循环，在60℃，45s的退火阶段收集荧光信号。

5.根据权利要求1所述的品系特异性定性、定量PCR检测方法，其特征在于，所述内标准基因定量PCR的反应条件为：反应体系总体积25μL，2.5μL1×PCR缓冲液，2.5μL2mM dNTPs，5μL25mM MgCl₂，10μM引物对ANS-F2/ANS-R2各0.5μL，0.5μL10μM探针ANS-Probe，0.3μL5U Taq DNA 聚合酶，5μL DNA和8.2μL双蒸水；反应程序：50℃，2min；95℃，10min；95℃，30s，60℃，45s，72℃，45S，45个循环，在60℃，45s的退火阶段收集荧光信号。