[发明专利]检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条及检测方法

权利要求书

1.一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于按以下步骤制备：

A、从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA；

B、用RT-PCR的方法克隆李痘病毒的外壳蛋白基因，然后将其连接到原核表达载体pET29(a)上，得到pET29a-PPV重组载体，以序列测定最终验证阅读框架正确的重组质粒，用以李痘病毒外壳蛋白基因的诱导表达；将pET29a-PPV重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)；

C、用亲和柱法回收特异性表达蛋白，再免疫家兔，获得李痘病毒抗血清；

D、采用上述抗血清制备出检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条。

2.根据权利要求1所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤A中从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA具体包括以下步骤：

(1)李痘病毒感病材料的幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成＜100mg小份至预冷E.P.管，100mg样品加入1mLTriZOL抽提；

(2)12000rpm，2-8℃离心10min；

(3)吸取上清液，转移至新的1.5mLE.P.管中，15-30℃放置5min；

(4)加0.2mL氯仿，充分抽提8min，15-30℃放置2-3min；

(5)12000rpm、2-8℃离心15min；

(6)吸取上清液，转移至新的1.5mLE.P.管中，加0.5mL异丙醇，15-30℃放置10min；

(7)12000rpm、2-8℃离心10min；

(8)弃去上清液，得胶体状RNA，加1-1.5mL75％乙醇，涡旋混匀；

(9)7500rpm、2-8℃离心5min，弃去上清，留下胶体状RNA；

(10)干燥5-10min；

(11)溶于RNase.free水中，枪头打匀，55-60℃温浴10min；

(12)5％Agarose胶检测，测定浓度并调至2-3μg/μL，-70℃储存备用。

3.根据权利要求1所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤B的具体方法包括：

a、RT-PCR扩增目的基因：

(1)引物

上游序列：PPV-F1：5’-CAGGATCCGCTGACGAAAGAGAAGAC-3’，其中GGATCC为BamHI酶切位点；

下游序列：PPV-R1：5’-TGAAGCTTCACTCCCCTCACACCGAG-3’，其中AAGCTT为HindIII酶切位点；

(2)扩增参数体系

模板RNA1μL

5μmol/L上游引物1μL

5μmol/L下游引物1μL

扩增酶混合液1μL

2×buffer12.5μL

RNase-freeddH₂O至总体积25μL

(3)扩增过程：

50℃30min，94℃3min，94℃1min，58℃30s，72℃1min，72℃10min，4℃；其中94℃1min，58℃30s，72℃1min，72℃10min循环35次；

b、基因克隆及序列测序：

(1)PCR产物的回收

取扩增产物在1％TBE琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕，切下目的条带，采用PCR产物回收试剂盒回收；

(2)重组质粒的构建

采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒；具体步骤为：电泳确定回收产物的纯度和浓度；向PCR管中依次加入约4μL回收产物，1μLpGEM18-T载体，5μL连接液，补充ddH₂O至总体积10μL；16℃下反应过夜；

(3)感受态细胞制备

于LB培养基平板上活化DH5α菌株，并挑取单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃下摇动培养过夜，形成种子菌液；取此5mL菌液，于100mLLB液体培养基，37℃摇动培养2～2.5hr，至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，冰浴5min，4℃下4000g离心10min，弃上清液，重复吸取菌液一次，沉淀用灭菌滤纸吸尽残液，加入300μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂重悬浮菌体，冰浴30min，4℃下4000g离心10min，收集沉淀，加入100μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂重新悬浮细菌沉淀，即为感受态细胞，于4℃冰箱中放置12～24hr备用；或加入70μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂和30μL50％甘油于-70℃保存备用；

(4)重组质粒的转化及筛选

从-70℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上，取10μL连接产物于100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，将离心管置于42℃水浴中热激90sec，迅速将离心管冰浴3～5min；每管中加入800μLLB液体培养基，37℃下摇动培养90min；

采用抗生素和α-互补法筛选重组质粒：取100mLLB固体培养基加热融化，待冷却至60℃以下时，加入100μLAmp，混匀后分倒4个培养皿；凝固后，每皿取4μLIPTG及40μLX-gal混匀后均匀涂布平板；待液体被吸收后取200μl转化后的菌液均匀涂于上述LB平板上，正向放置30min待液体被吸收，37℃下倒置培养16～24hr；挑取直径约为1～2mm大小的白色菌落于5mLLB液体培养基中37℃下摇动培养12～16hr，标记后取0.7mL与0.3mL50％(v/v)的灭菌甘油混匀后，置-80℃下保存备用，其余菌液用于重组质粒抽提及鉴定；

(5)重组质粒的抽提

经抗生素及α-互补法筛选得到的待检菌落培养物于4℃冰箱内预冷5～10min，采用碱裂解法抽提质粒DNA；具体步骤如下：离心管标号，取含重组质粒的菌体液1.5mL至离心管中，4℃、12000g、离心1min，弃上清，重复加菌体液一次，离心后将管倒置于吸水纸上，待流尽余液后加入150μL溶液I，剧烈振荡，使菌体悬浮，室温放置5～10min，加入250μL溶液II，颠倒离心管数次，温和混匀，室温放置5min，加入180μL溶液III，盖紧离心管，温和颠倒离心管数次，使沉淀混匀，冰浴6～7min，4℃、12000g离心10min，上清液移入干净的离心管中，分别加入1/2体积的氯仿/异戊醇、Tris饱和苯酚，混匀，4℃、12000g离心5min，取上清，氯仿/异戊醇再抽提一次；上清水相移入干净离心管中，加入1/10体积NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，-20℃冰箱中20min或过夜，4℃、12000g离心10min，弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上，吸干余液，70％、100％乙醇各洗一次，室温下风干，加入20μLTE，-20℃冰箱中备用。

(6)重组质粒的鉴定

①、特异引物PCR鉴定

利用特异引物对待检重组质粒进行PCR扩增。反应体系程序参数同上，PCR产物在1％TBE琼脂糖凝胶上电泳鉴定；凡含有目的扩增片段的克隆，进一步进行酶切鉴定；

②、重组质粒酶切鉴定

经PCR鉴定阳性的重组质粒，以下列体系进行双酶切：10×HBuffer1.5μL，BamH10.5μL，HindIII0.5μL，待检质粒4μL，加ddH₂O至总体积15μL，37℃下反应过夜，取10μL反应液电泳检测酶切结果；

③、重组质粒序列测定

经上述PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，扩繁菌体，抽提并纯化质粒后，利用通用测序引物对重组质粒进行序列测定；

c、PPVCP基因原核表达载体的构建：

以BamH1和HindIII分别双酶切PPVCP/-T重组载体和表达质粒pET29(a)，将经双酶切的产物都以1％的琼脂糖凝胶进行电泳，并切胶回收纯化，纯化产物与双酶切载体进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α；用PCR和质粒酶切鉴定方法筛选出的阳性重组子后，再进行DNA测序，以验证阅读框的正确性；

d、CP基因诱导表达及SDS-PAGE分析：

将阅读框正确的重组子质粒pET29a-PPV转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种于3mlLB的液体培养基中，37℃摇床中活化培养过夜后，按1∶100稀释到新鲜的LB培养基中，37℃，200rpm振动培养至OD600达到0.5-1.0，加入IPTG至终浓度1mM，继续于37℃培养；分别于不同的时间段取样，离心收集菌体，加适量TE溶液pH8.0，震荡悬浮，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸3min，13.5％的SDS-PAGE电泳分析PPVCP基因的蛋白表达情况；电泳结束后的聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝R-250染色1h，室温摇床脱色3h；

e、表达产物的纯化：

根据预表达结果，选取高效表达菌株，以IPTG诱导大量表达，并离心收集菌体；菌体可于-20℃保存；称取适量菌体，以20mM磷酸缓冲液pH8.0悬浮，加入蛋白酶抑制剂CocktailsetIII和溶菌酶，冰上置30min，再加等体积的8M尿素磷酸缓冲液pH8.0，震荡混匀2min；于4℃，10000rpm离心10min，上清液以0.45μm过滤器抽滤后，上样Ni-NTA预装柱，然后进行纯化；

经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析，将含有洗脱纯化蛋白的收集液以含尿素浓度梯度递减的50mMTris缓冲液透析去除尿素，并以紫外分光光度计测定法测定回收蛋白的含量。