[发明专利]从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法。

技术背景

藻类中的藻蓝蛋白作为蛋白存储单位，具有明显的抗氧化、抗炎症、增强机体免疫能力作用，抗辐射等活性。藻蓝蛋白分离纯化后，成为高度荧光性的蛋白质，可作为荧光探针等生物医药制剂。现有的藻蓝蛋白的分离纯化工艺主要包括沉淀、离心、透析、层析等过程，这一系列的方法开展困难且昂贵，并且得到的纯度也不高，只适用于实验室制备藻蓝蛋白。

Ganapathi Patil报道了一种纯化C-藻蓝蛋白简单有效的新方法，其中包括双水相萃取和离子交换色谱两个步骤。使用高压均质法提取粗蛋白，经过高速离心后取上清液，在双水相萃取中，使用聚合体-无机盐体系，聚合度4000的聚乙二醇和磷酸钾溶液作为两相，体积比为0.8，在pH6.0的条件下使得纯度为1.18的粗提液，经过一次萃取后纯度上升到了3.52，而经过3次萃取后纯度达到了4.05（Ganapathi Patil，K. S. M. S. Raghavarao．Aqueous two phase extraction for purification of C-phycocyanin [J] ．Biochemical Engineering Journal ，2007，34：156–164．）。

Ruperto Bermejo等使用阴离子表面活性剂Aerosol OT（丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠，简称AOT）通过荧光光谱研究C-藻蓝蛋白在水/AOT/异辛烷的溶解特性。结果显示，当W₀>30%时C-藻蓝蛋白溶解于反胶团中。制得的溶解于非极性溶剂中的藻蓝蛋白可以替代合成燃料用于食品和化妆品中（Ruperto Bermejo，Eva M. Talavera，Carmen delValle，et al．C-phycocyanin incorporated into reverse micelles: a fluorescence study [J] ．Colloids and Surfaces B: Biointerfaces ，2000，18：51–59．）。

刘杨研究了CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）/正戊醇-正辛烷反胶团溶液萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白的性能。结果表明0.04 mol/L CTAB/正戊醇-正辛烷（体积比1:4）的反胶团体系用于萃取pH7.0，包含0.1 mol/L KCl 的螺旋藻细胞破碎液，藻蓝蛋白萃取率可达96.3%； 采用pH5.0，包含 2 mol/L KBr 的反萃液反萃取藻蓝蛋白，反萃取率可达90.6%（刘杨，王雪青，庞广昌．反胶团萃取分离螺旋藻藻蓝蛋白 [J] ．天津科技大学学报，2008，6（2）：30—33．）。

Pertti J. Viskari等人利用3% 3-[3-（胆酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸（Chaps）和0.3%氮成穴大豆蛋白提取藻胆蛋白，提取率达到85%以上，并且提取全过程在3小时内完成，其产物经过毛细管电泳激光诱导荧光检测，得到了很好的效果（Pertti J. Viskari，Christa L. Colyer．Rapid extraction of phycobiliproteins from cultured cyanobacteria samples [J] ．Analytical Biochemistry，2003，319：263–271．）。

张厚森通过实验室自制羟基磷灰石色谱柱对藻蓝蛋白进行吸附，并通过梯度洗脱和透析脱盐，得到了纯度为2.83的藻蓝蛋白。而经过两次HA柱的藻蓝蛋白纯度达到4.21，总回收率为38.1%（张厚森．钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取分离及稳定性研究 [D] ．江苏：江苏大学，2005．）。

   以上分离制备方法存在缺陷：一则可能产生较多的非食用的添加物质；二则分离纯化过程中样品的损失也较大，造成产量过低；另外大量的溶剂洗脱和多级柱分离，使分离成本大幅度提高，难以实现规模化生产。

发明内容

为了克服现有技术提取藻类藻蓝蛋白产量低、成本高的不足，本发明提供了一种从藻类中分离制备药用级藻蓝蛋白的方法。

本发明采取的技术方案如下：