[发明专利]一种大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺

说明书

技术领域

本发明涉及凝胶层析技术领域，特别是一种大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺。

背景技术

凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。

凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。

Vo简称为外水体积，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。

Vi简称内水体积，可由g·Wr求得（g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL/g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积Ve计算，即

Ve＝Vo＋Vi

对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示：

Ve＝Vo＋K_D·Vi

式中Ve为脱体积，它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。K_D为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的分配系数，它只与被分离物质分子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。K_D可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。

Ve＝Vo＋K_D·Vi

可改写为：

K_D=（Ve-Vo）/Vi

当K_D＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；

当K_D＝1时，即Ve小分子＝Vo＋K_D·Vi，说明这种溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。

但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上Ve小分子＝Vo＋0.8Vi；当0＜K_D＜l时，意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散，K_D愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；K_D＝0.5时，其洗脱体积Ve＝Vo+0.5Vi。

凝胶层析技术的优点：凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。

凝胶层析技术的缺点：在大生产中，由于需要较高的分离效率，通常需要设计直径达20cm的大型层析柱，但由于技术原因，大型层析柱不能达到1m的有效分离柱长，通行做法是将两根50cm的层析柱串联起来使用，达到理想的分离效果。串联式大型凝胶层析柱虽然解决了工业化生产上的纯化效率需求，但一套串联式大型凝胶层析系统的价格十分昂贵，而其中主要的成本集中在凝胶层析柱上。因此，提高层析柱的使用效率是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种提高纯化效率，降低设备成本的大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种大型凝胶层析柱纯化有机大分子物质的工艺，它包括以下步骤：