[发明专利]可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白及其重组载体与应用

权利要求书

1.一种可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白，其特征在于：编码所述的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于：含有编码如权利要求1所述的可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体为将SEQID NO.2所示的基因克隆至慢病毒载体得到。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述的慢病毒载体为CSII-EF-RfA-IRES2-Venus。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体为CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH重组质粒，其通过如下方法制备得到：

（1）以结核杆菌DNA为模板，以FP和RP为引物，PCR反应获得Gyrase B基因；

FP：ATCGGAATTCATGTCGAACTCTTATGACTCCTCC；

RP：ATCCACTAGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA GCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC；

（2）通过EcoR I酶和Spe I酶分别双酶切pENTR-2B载体和步骤（1）得到的Gyrase B基因，酶切后纯化，得到双酶切的pENTR-2B载体和双酶切的GyraseB基因；再将双酶切的pENTR-2B载体和双酶切的Gyrase B基因连接，得到重组载体pENTR-2B-Gyrase B-HA；用EcoR I酶单酶切重组载体pENTR-2B-GyraseB-HA，去磷酸化，得到单酶切后的pENTR-2B-Gyrase B-HA；

（3）以小鼠脾脏cDNA为模板，FP2和RP2为引物，PCR反应扩增得到包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段；用EcoRI酶单酶切包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段，得到单酶切后的包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段；

FP2：ATCGGAATTCATGAGTCTCTTAAACTGTGAG

RP2：ATCCGAATTCGTTACACTGCTGTGCTTCCATTTC；

（4）将步骤（2）得到的单酶切后的pENTR-2B-Gyrase B-HA和步骤（3）得到的单酶切后的包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段连接，得到重组载体pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH；

（5）通过Gateway技术将位于重组载体pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH上的T6RZ-GH双链DNA片段转移至慢病毒载体CSII-EF-RfA-IRES2-Venus上，得到重组质粒CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：

步骤（1）和（2）中所述的PCR反应的条件为：94℃2min；94℃15sec、55℃15sec、68℃30sec，30个循环；72℃10min。

8.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：

步骤（5）所述的Gateway技术的反应体系为：

其中，TE的组成为10mM Tris-HCl、1mMEDTA，pH值为8；

反应条件为：25℃下反应6小时，加1μl浓度为2μg/μl的蛋白酶K，37℃反应10分钟。

9.权利要求3～8任一项所述的重组载体在TRAF6功能研究中的应用。