[发明专利]一种复合抗冻液及其应用和使用该抗冻液保存人羊膜的方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织细胞保存技术领域，具体涉及一种复合抗冻液及其在人羊膜液氮保存中的应用和使用该抗冻液保存人羊膜的方法。

背景技术

人羊膜(以下简称羊膜)分为上皮层、基底膜层、致密层、纤维母细胞层和海绵层，其中后三层又称为基质层。羊膜中有细胞与基质，其中细胞又分为羊膜上皮细胞（为干细胞，分布在上皮层）和羊膜间充质干细胞（分布在基质层），羊膜的这二种干细胞已被证明均具有进一步向不同组织细胞分化以及分泌多种细胞因子的干细胞特性。其基质也是良好的细胞支架材料。另外，羊膜还具有抗原性弱、无致瘤性、不受来源与伦理限制的优势。因此，羊膜在医学多个领域的应用越来越广泛、需求也越来越大。

解决羊膜在多个领域越来越大的需求之措施是将新鲜羊膜长期保存并建立羊膜库，并使保存的羊膜细胞及基质活性与新鲜羊膜相似，一旦需要随时将保存羊膜复温即可应用。

目前羊膜的保存分为常温与深低温保存二大类：1、常温保存方法简单，就是将新鲜羊膜放在某些培养液中置于普通冰箱保存，但保存时间短、1～2周后其活性基本丧失，该方法显然只能对新鲜羊膜进行短暂的保存。2、深低温保存方法又分为-80℃低温冰箱保存与-196℃液氮保存，因后者较前者保存时间更长（理论上可“永久”保存）而用于羊膜的长期保存。

国外Lee和Tseng采用DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)/甘油为抗冻剂成功地将羊膜在-80℃条件下储存，此法被美国食品药品管理局所推荐；但也有研究表明DMEM／甘油深低温保存的羊膜活性锐减，其原因可能是在-80℃条件下分子运动未完全受抑制、细胞代谢（包括酶代谢）过程并未完全停止，随着保存时间的延长细胞活性减低乃至死亡、羊膜细胞分泌细胞因子的功能也因此受到影响或障碍。而在-196℃液氮条件下，细胞内各种代谢接近于“冬眠”或停止，理论上可“永久”保存羊膜细胞活性。

目前国内有学者采用简化一步保存法(以(M199液/lO%DMSO为抗冻剂)将羊膜储存于液氮中，该方法属于慢降温法：是将羊膜经抗冻剂预处理后先用程序降温仪（期间用液氮降温）将羊膜逐步降到-80℃后再放入液氮保存。慢降温法需要昂贵的程序降温仪，其操作步骤多、耗时长、被污染的环节与费用也增加，尤其是要大量保存羊膜并建立羊膜库时，简化一步保存法的不足显而易见。如能研究一种无需程序降温仪、保存效果好的快速降温方法，即：将经抗冻剂预处理的羊膜直接放入液氮保存即可，其优势是不言而喻的。

然而在液氮保存羊膜时，冰冻降温与复温二个阶段都会对羊膜干细胞造成严重损伤，使保存的羊膜干细胞活性及其分泌功能受到明显的影响。为减轻低温对羊膜干细胞损伤，公认的方法是先用抗冻剂对羊膜进行预处理再进行冻存。

抗冻剂减轻冷冻过程中对组织损伤的作用机制较复杂，可能与下列因素有关：1、减低冰晶形成速度与大小，从而减轻冰晶对细胞的直接损伤；2、减轻了细胞内外冰晶形成带来的细胞内外通透性变化；3、稳定细胞膜的结构，提高细胞膜流动性，减轻细胞膜损伤；4、二甲基亚砜(DMSO)还具有氧自由基清除作用。但抗冻剂（尤其是高浓度穿透性抗冻剂）本身也会造成细胞损伤。现有技术中，将抗冻剂分为穿透性与非穿透性二种，常用的抗冻剂有二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇、甘油等，各种抗冻剂作用机制有所不同。由于单一抗冻剂很难达到冷冻保护的要求且毒性也大，因此目前常采用多种不同作用机制的抗冻剂联合组成深低温冻存的保护剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种复合抗冻液及其应用和使用该抗冻液保存人羊膜的方法。采用本发明所述复合抗冻液对新鲜人羊膜进行预处理后不需使用程序降温仪降温即可直接置于液氮中保存，在简化步骤、节约成本的同时缩短了预处理的时间、减少了污染，并可长期有效维持羊膜活性。

本发明所述的一种复合抗冻液，它由基础抗冻液和海藻糖组成，所述的基础抗冻液由DMEM培养液、甘油和二甲基亚砜按4.5～5.5：3.5～4.5：0.5～1.5的体积比组成，所述海藻糖在复合抗冻液中的浓度为0.05～0.15mol/L。

上述复合抗冻液配方中，

所述基础抗冻液优选由DMEM培养液、甘油和二甲基亚砜按5：4：1的优选体积比组成。其中DMEM培养液可以是高糖型的也可以是低糖型的，优选低糖型。

所述海藻糖在复合抗冻液中的浓度优选为0.1mol/L。