[发明专利]多重耐药鲍曼不动杆菌的高效抗菌活性反义核酸序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种反义核酸序列，具体为一种抑制多重耐药鲍曼不动杆菌杆菌生长的反义核酸序列。

背景技术

反义技术是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸从而抑制特定基因表达，近年来其发展极其迅速，作为一种新的基因治疗手段，反义技术已经被广泛应用于病毒感染、肿瘤、遗传性疾病等医学研究，并取得了丰硕的成果，具有极其重要的理论和实际意义。原核生物与真核生物相比，具有基因组结构简单，生长调控机制相对单一等优势，将反义技术应用于原核生物系统无疑有着“神奇”的应用潜力。

目前，几乎所有临床应用的抗生素都出现了相应的耐药菌，因此采用传统靶点筛选出来的抗生素难以避免耐药的问题。科学家已经完成了多种重要致病菌的全基因组测序工作，新一代测序技术将使这一名录迅速增加。这些庞大的基因组序列信息为后基因组时代分析基因功能并借此寻找新的抗菌药物作用靶点提供了可能。近年来，采用反义技术在基因组范围内筛选鉴定致病菌必需基因的研究进展显著，而这些必需基因有可能发展为新的抗菌药物靶点近年来，反义技术在新型抗菌药物研发中发挥了重要作用。人们采用反义技术鉴定必需基因，发现了许多具有发展前景的抗菌药物作用靶点；针对耐药基因的反义核酸能够有效逆转耐药菌对现有抗生素的敏感性，针对生长必需基因的反义核酸具有显著的抗菌活性，通过改善其细胞吸收特性以及抗菌活性，反义核酸有望发展成为新一代抗菌药物，为人类造福。

鲍曼不动杆菌广泛分布于环境中和健康人群中，极易在医用材料上黏附，能引起人呼吸道、泌尿道、中枢神经系统等多部位的感染，近年来由于广谱抗生素的大量应用，该菌引起的感染明显上升。目前现有抗生素对于多重耐药甚至泛耐药的鲍曼不动杆菌引起的感染治疗困难，由于其耐药机制复杂且极有可能存在新的耐药机制，因此传统的抗菌药物在治疗中有相当的局限性，迫切需要开发出新的抗菌制剂。

反义核酸可以通过与靶基因的特异性结合形成空间位阻，抑制靶基因的转录和翻译。以细菌生长的必须基因为靶，利用反义核酸使其生长所需必须蛋白缺失，可达到抑制细菌生长的目的。从基因水平上寻找治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的方法有望成为抗感染治疗的新途径。

gyrA基因是细菌生长的必需基因，作为拓扑异构酶ⅡA亚基的编码基因，在细菌DNA复制中发挥重要作用，抑制其表达可抑制细菌的生长。反义核酸对靶基因的抑制作用关键在于能否形成稳定的DNA:RNA杂化双链(heteroduplexes)结构。由于mRNA二级结构的空间位阻作用，只有少数位点可与反义核酸结合从而发挥基因表达下调作用，因此有效核酸序列的设计筛选是反义技术的关键。目前为止还没有针对多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的高效反义核酸序列。

发明内容

为了克服多重耐药鲍曼不动杆菌对现有抗生素广泛耐药，抗感染治疗成功率低的难题，本发明提供了一种针对多重耐药鲍曼不动杆菌具有高效抗菌活性的反义核酸序列，该序列为一段人工合成的核苷酸序列，它与多重耐药鲍曼不动杆菌必需基因gyrA特定位点序列是互补的。将一定剂量本发明所述的反义核酸序列加以稳定性修饰并转至菌体内，该类反义核酸能够与靶基因特异性结合从而抑制靶基因的表达，达到高效、低毒或无毒地抑抑制多重耐药鲍曼不动杆菌的生长的目的，进而治疗与其感染有关的疾病。

本发明是采用如下技术方案实现的：

1.本发明针对gyrA基因全长编码区序列，通过利用Mfold和RNA structure4.6两种mRNA二级结构分析软件预测分析gyrA mRNA的二级结构，以最低自由能原则绘制37℃时gyrA mRNA的二级结构图，并进行自由能计算，包括OverallΔG、DuplexΔG、Break targΔG、oligo-selfΔG和oligo-oligoΔG等参数，选择mRNA局部杂交松弛区，如发卡、膨胀环、内环等结构区域，设计反义寡核苷酸探针。利用斑点杂交技术，将设计的反义寡核苷酸探针与地高辛标记的gyrA mRNA分子进行原位杂交，验证其与靶基因结合的有效性，筛选出一条能与gyrA基因稳定结合的反义核酸序列。

2.根据以上1项所述的反义核酸序列，其特征在于，具有与多重耐药鲍曼不动杆菌gyrA基因的下述序列(Seq ID No.1)互补的核苷酸序列：5’GAUGGUGAUAGCGCUGCGGC 3’

3.根据以上1项所述的反义核酸序列，其特征在于，具有下述序列(Seq ID No.2)：

5’GCCGCAGCGCTATCACCATC 3’