[发明专利]一种生产α淀粉酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建微生物工程菌生产重组蛋白。具体是应用微生物工程菌生产混合α淀粉酶。

背景技术

α淀粉酶(α-amylase，EC 3.2.1.1)广泛存在于生物界。α淀粉酶能够催化随机水解淀粉的α-1，4-糖苷键，产生麦芽糖、麦芽三糖和α糊精。α淀粉酶广泛应用于饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、酒精、白酒、味精和医药等行业。当前市场上的α淀粉酶产品是来源于天然菌株生产的α淀粉酶。但是，由于天然的产α淀粉酶菌株的生长缓慢，营养要求较高，使酶的生产成本较高；另之，当前的α淀粉酶产品的适合反应温度范围和适合反应pH范围窄，不能满足当前市场的需求。

由于α淀粉酶有多种来源，那么，不同来源的α淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的α淀粉酶的理化特性可不相同。毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)都是常用于生产重组蛋白的宿主菌，但各具有特征。毕赤酵母的主要特征是分泌极少自身蛋白有利于表达产物的纯化的特点，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有兼性需氧的特性，适合于固态厌氧发酵生产重组酶。

发明内容

根据α淀粉酶有多种来源，不同来源的α淀粉酶的基因序列可不相同，不同来源的α淀粉酶的理化特性可不相同，如果将某些不同理化特性的α淀粉酶基因重组于同一个细胞的基因组进行表达，那么，所表达的混合α淀粉酶将具有理化特性多样性，即具有多个最适温度和最适pH。这种混合酶将比其中单种酶的使用价值高。来源于大麦(Hordeum vulgare)的α淀粉酶最适合pH 5，最适温度70℃，在pH5-6和35至73℃的温度下有＞60％的酶活性；来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)的α淀粉酶最适pH 8.5，最适温度80℃，在pH5-9.5和55-90℃有＞60％的酶活性；来自于曲霉(Aspergillus)的α淀粉酶最适合pH 4，最适温度是70℃，在pH 3-6和50-75℃有＞60％的酶活性。由于这三种酶的功能相同，所以，这三种在毕赤酵母或酿酒酵母或枯草芽孢杆菌中表达的混合α淀粉酶适合于在酸性、中性、碱性、常温、中温和较高温度的条件下使用。即这种混合酶的用途将比其中的单独酶广。若分别用不同的菌株来表达这三种酶，其生产成本将高于用一个菌株同时生产这三种酶的混合酶。本发明构建含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母工程菌、酿酒酵母工程菌和枯草芽孢杆菌工程菌，生产重组混合大麦的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶和曲霉的α淀粉酶基因编码的α淀粉酶。

本发明所采用的技术方案是：

1.克隆酶基因：应用分子生物学技术，分别从大麦基因组、地衣芽孢杆菌基因组和曲霉基因组中扩增α淀粉酶基因。

2.获得应用于表达载体构建所需的启动子，重组序列，信号肽，转录终止子和抗性基因。

3.构建如附图1、附图2和附图3的含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体。

4.将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体转化毕赤酵母；将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的酿酒酵母表达载体转化酿酒酵母；将含大麦的α淀粉酶基因表达框架、地衣芽孢杆菌的α淀粉酶基因表达框架和曲霉的α淀粉酶基因表达框架的枯草芽孢杆菌表达载体转化枯草芽孢杆菌。[说明.表达框架：启动子-信号肽-基因-转录终止子]