[发明专利]psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体及构建方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及基因工程领域,特别涉及一种利用口蹄疫病毒2A序列构建草莓psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体及构建方法。

【背景技术】

类胡萝卜素（Carotenoids）是自然界中广泛存在的色素，是植物、细菌、真菌光合反应必不可缺的成分，在高等植物中，类胡萝卜素主要存在于叶片的叶绿体以及许多花和果实的有色体中，使花和果实呈亮黄色、橙色或红色。越来越多的医学研究表明，除了不少类胡萝卜素是维生素A的前体外，许多类胡萝卜素在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面起着重要的作用。因此类胡萝卜素既是决定水果、蔬菜内在营养品质的重要指标，也是影响果实外观品质和花卉观赏价值的重要因素，了解植物类胡萝卜素积累的特点与代谢的生理机制，对于进一步调控植物类胡萝卜素的生物合成途径，改善园艺植物的食用品质和观赏品质具有重要的意义。八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)、八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase，PDS)和ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase，ZDS)是类胡萝卜素生物合成过程中关键酶。PSY是类胡萝卜素生物合成过程中关键酶之一，它催化两个牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)缩合形成八氢番茄红素，八氢番茄红素是整个类胡萝卜素合成途径中第一个类胡萝卜素分子。由于PSY是植物中类胡萝卜素生物合成的一个限速酶，所以由GGPP生成八氢番茄红素这一步骤已成为类胡萝卜素代谢途径的“瓶颈”，而其编码的基因也成为应用基因工程技术改善植物类胡萝卜素含量的首选目的基因。PDS和ZDS是植物类胡萝卜素合成中去饱和的非常重要的一类酶，参与线状类胡萝卜素生物合成。PDS催化八氢番茄红素连续两次脱氢生成ζ-胡萝卜素，然后在ZDS催化下，ζ-胡萝卜素脱氢生成链孢红素继而进一步脱氢生成番茄红素，PDS和ZDS都是类胡萝卜素合成途径中的重要限速酶。

将外源基因导人植物基因组是植物分子生物学和遗传工程的一项基本技术。基因转化首先必须构建含有目的基因的植物表达载体，植物表达载体的构建是一个十分复杂的过程，要综合考虑了目的基因的编码区和植物表达载体的酶切位点及翻译蛋白移码问题基础上，涉及到多次大分子重组，每次重组过程又包括质粒提取、酶切、回收、连接、转化和筛选鉴定等工作。由于生物体内的代谢途径常常涉及多步反应，除了需要单个酶催化，更需要两个或多个酶共同催化。因此将多基因转化到同一植物中，就显得很有必要了。多基因表达载体构建与转化技术的诞生使多个目的基因导入植物基因组中并在植物中表达得以实现。多基因融表达载体策略是多个目的基因的DNA序列融合在一起，使其处于同一表达框内，多个基因在同一个启动子下转录成一个转录本，翻译后得到一个由不同的功能蛋白拼合在一起而形成的新型多结构域的人工蛋白。在构建多基因融合表达载体时，需要在不同的基因之间加入连接肽，以避免不同蛋白之间产生空间位阻，抑制其它蛋白的折叠或活性。如果是相互作用的两个基因，空间位阻也会阻碍二者的结合，而加入连接肽则可以解决这个问题。口蹄疫病毒FMDV(Foot-and-mouth disease virus)2A序列是目前比较常用的连接肽。FMDV 2A序列为20个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为QLLNFDLLKLAGDVESNPGP，由2A连接的多基因，不需要任何蛋白酶的参与，便可在在第19个氨基酸(G)和第20个氨基酸(P)之间发生剪切，从而将多聚蛋白“切割”成不同的功能蛋白。通过2A序列融合多基因在一个开放阅读框下，可在共表达时发挥其各自基因的功能作用，目前已经广泛应用各类生物当中。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体，通过psy、pds和zds基因协同表达能够提高草莓果实类胡萝卜素含量，并为研究草莓类胡萝卜素生物合成途径中各种代谢酶的调控功能以及类胡萝卜素积累特点和代谢机制奠定技术平台。

本发明是这样解决的技术问题之一的：

一种psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体，所述psy、pds和zds基因三价融合植物表达载体的基因序列如SEQ ID NO.1所示。