[发明专利]用于检测CBFβ/MYH11融合基因相对表达量的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，用于检测人类急性髓细胞性白血病(acute myelognous leukemia，AML)患者体内CBFβ/MYH11融合基因表达水平，同时对高危人群进行较为准确的筛查。该试剂盒可有效的节约检测时间，提高检测精度。

背景技术

Acute myelocytic leukemia 即急性髓细胞白血病，其病情进展迅速，自然病程仅有数周至数月，目前还没有找到真正的致病因，一般认为遗传、辐射、化学物质（如苯）、药物及其他职业上的暴露（如浓烟、颜料、杀虫剂等）可能与AML的发生有关。临床上，根据血象、骨髓象、细胞化学染色、免疫学染色的检测结果将急性骨髓系白血病分为M0~M7，8种亚型。

M_4E0是M4型白血病中的一种特殊类型。患者骨髓中粒系和单核系原始细胞同时恶性增生，嗜酸粒细胞占5％-30％。Inv(16)(p13；q22)/t(16；16)(p13；q22)为急性髓系白血病(AML)-M_4EO的非随机染色体异常，是由16号染色体长臂上的CBFβ基因与短臂上的平滑肌肌球蛋白重链基因(MYH11)产生融合所致，形成CBFβ/MYH11和MYH11/CBFβ两种融合基因。其中CBFβ/MYH11融合基因易促使白血病发病。迄今已发现10种CBFβ/MYH11融合基因转录本，最为常见的是A型，即CBFβ⁴⁷⁴/MYH¹⁹²¹，占88％，其次为D型(CBFβ⁴⁷⁴/MYH¹²⁰¹)和E型(CBFβ⁴⁷⁴/ MYH⁹⁹⁴)，这两型检出率均为5％，其他类型均只有个案报道。与其他AML亚型相比，(AML)-M_4EO患者多为中青年，常有外周血白细胞计数升高、器官肿大、对化疗药物有良好反应。大多数研究认为，有较好的预后，有inv(t6)者完全缓解率可达90％～100％ ，近50％能够获得5年无病生存(DFS)，但中枢神经系统复发较常见。

CBFβ/MYH11的致白血病机制尚不清楚，在CBFβ/MYH11基因敲除小鼠中，CBFβ/MYH11显性负抑制CBF对其靶基因的转录调控活性。间接免疫荧光染色证实CBFβ/MYH11基因表达产物CBFβ/SMHHC与野生型CBFβ一样定位于胞浆，当CBFβSMHHC与AML1共表达时，CBFβ/ SMHHC可将AML1蛋白部分扣留于胞浆， CBFβ/SMHHC融合蛋白的AML1胞浆扣留是CBFβ/SMHHC显性负抑制CBF对其靶基因的转录激活的主要机制。有研究发现，CBFβ/SMHHC与野生型CBFβ相比，其与AML1具有更高的亲和性，当二者共表达时大部分CBFβ/SMHHC融合蛋白已从胞浆进入胞核，而CBFβ/SMHHC、AML1与mSin3A可形成转录抑制复合物，因此，CBFβ/SMHHC显性抑制CBF对其靶基因的转录激活的另一机制是通过CBFβ/SMHHC与野生型CBFβ竞争性结合AML1，在胞核内与AML1及一些转录抑制辅助因子(如mSin3A等)形成转录抑制复合物所致。

目前临床上已经将CBFβ/MYH11融合基因作为动态评估患者病情及预后的手段之一。常用的检测技术有荧光原位杂交技术(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法尽管结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。而单纯RT-PCR法则为终点定量，无法对起始模板量进行准确的估算。此外，由于砷剂及全反式维甲酸的应用，APL治疗效果得到很大的提高，微小残留病是其复发的主要原因，因而急需一种高敏感性、高特异性、高自动化程度、污染控制好的方法来对CBFβ/MYH11融合基因mRNA残留进行检测。