[发明专利]细胞色素P450 BM-3变体酶及其编码基因和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种变体酶，尤其涉及一种细胞色素P450 BM-3变体酶及其编码基因和用途。 

背景技术

靛蓝是一种具有悠久历史的天然染料，无论是古埃及木乃伊穿着的一些服装，还是我国马王堆汉墓出土的蓝色麻织物，它们的颜色都来自靛蓝。靛蓝之所以得到人们长期、广泛的青睐，最关键的一点在于它具有其它染料无法比拟的染着牢固度和耐光坚牢度，因此，靛蓝也被称为“染料之王”。 

在远古时代，靛蓝主要从含有靛蓝的植物(如菘蓝、蓼蓝、木蓝等)中获得。到了19世纪中叶，由于天然靛蓝的生产无法满足纺织工业迅猛发展的需求，人们开始尝试采用化学方法合成靛蓝。1897年，德国巴斯夫生产的合成靛蓝问世，并以生产简便、原料充足、纯度高、易贮运、使用方便等优点，得以迅速普及，最终使得应用了几千年历史的植物靛蓝黯然失色，于20世纪60年代退出了历史舞台。20世纪80年代后，随着社会文明程度的提高和环保意识的增强，天然靛蓝重新获得了人们的关注和重视。 

采用化学方法合成靛蓝时，需要使用对呼吸道、中枢神经及肝脏均有毒害、可导致人体中毒的苯胺和邻苯二甲酸酐。这不仅影响了所合成的靛蓝的安全性，而且也对环境具有污染。由于而今不可能再大量种植与粮食作物争地的产靛蓝植物，人们把生产天然靛蓝的希望寄托于靛蓝的生物制备技术，试图通过那些能催化吲哚转化为靛蓝的生物催化剂实现靛蓝的绿色制备。利用生物催化剂进行靛蓝的生物制备具有生产成本低、生产条件温和、能耗低、产生的有害废物少、产品安全等优点，对保护环境、维持生态平衡等具有明显优势，所以，生物法生产靛蓝取代靛蓝的化学合成得到了很多研究者的认同和重视。 

目前，已经发现了一系列能催化吲哚生产靛蓝的生物催化剂，其中最受关注的是一种细胞色素P450BM-3酶。在P450酶系中，细胞色素P450BM-3酶是从巨大芽孢杆菌(B.megaterium)中发现的具有中长链脂肪酸羟基化活性的P450酶，在NADPH和分子氧的存在条件下，可以迅速催化链长为C12～C18的饱和脂肪酸末位羟基化，将单个氧插入到不活泼的碳氢键中。 

2000年，德国斯图加特大学技术生化研究所R.D.Schmid领导的科研小组，通过定向进化技术获得了具有三个突变位点、能够催化吲哚生成靛蓝的细胞色 素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶，这使细胞色素P450BM-3酶第一次获得了催化靛蓝产生的能力(“Directed evolution of the fatty-acid hydroxylase P450 BM-3 into an indole-hydroxylating catalyst”Chemistry-A European Journal，LiQ S，Schwaneberg U，Fischer P，Schmid R D.2000，6：1531～1536)。但是，该变体酶催化吲哚生产靛蓝的活力还较低，因此有必要通过进一步的蛋白质改造，提高细胞色素P450BM-3酶对吲哚的亲和力和催化活力，提高靛蓝生物制备的效率。 

公开号分别为“CN 1900285A”、“CN 1900286A”、“CN 1900287A”的中国专利公开了三种细胞色素P450BM-3酶的变体基因，该三种变体基因分别将第168位天冬氨酸的密码子突变为组氨酸的密码子、将168位天冬氨酸的密码子突变为亮氨酸的密码子、将435位谷氨酸的密码子突变为苏氨酸的密码子，该三种变体基因编码的细胞色素P450BM-3酶与底物亲和能力较低。 

发明内容

本发明提供了一种细胞色素P450BM-3变体酶，解决了现有变体酶与底物亲和力较小，热稳定性差，催化吲哚生成靛蓝的效率较低的问题。 

一种细胞色素P450BM-3变体酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q/D168L/E435T/V445A)变体酶或细胞色素P450BM-3(D168L/E435T/V445A)。 

本发明通过定点突变，在细胞色素P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)变体酶的基础上引入了三个突变位点，即168位点由天冬氨酸(D)突变为亮氨酸(L)，435位点由谷氨酸(E)突变为苏氨酸(T)，445位点由缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)，该突变位置序号为蛋白不包括起始密码子编码氨基酸的顺序号。