[发明专利]表达猪捷申病毒8型VP1蛋白的重组腺病毒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有猪捷申病毒8型VP1基因序列的重组腺病毒以及该重组腺病毒在预防或治疗猪捷申病中的应用，属于猪捷申病的防治领域。

背景技术

猪捷申病（teschen diseaes）最初发现于捷克的捷申地区，是一种急性的致死性猪传染性疾病，能引起严重的中枢神经系统紊乱，又命名为猪捷申病毒脑脊髓炎（teschovirus encephalomyelitis），该病是由Teschen毒株感染引起，属于猪捷申病毒（Porcine teschovirus,PTV）1型。1956年英国威尔士出现了另一种形式的脑脊髓灰质炎疾病，引起猪的神经症状较轻，属于温和型脑脊髓灰质炎，命名为塔尔凡病（talfan disease），该病是由Talfan毒株感染引起，也属于PTV-1。随后在北美洲、澳大利亚、非洲以及亚洲等地区相继分离到了PTV的其他血清型毒株，而且引起的症状呈现多样性：神经系统紊乱、繁殖障碍、肺炎、鼻炎、腹泻、心包炎和心肌炎以及皮肤损伤等。目前在我国主要和猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）混合感染较多，主要引起高热病、流产、仔猪死亡以及腹泻、肠炎等。

PTV基因组为单股线状正链RNA，只含有一个大的开放阅读框，编码翻译合成一个大的多聚蛋白，最终形成4种结构蛋白和7种非结构蛋白。PTV的衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3、VP44种蛋白粒子构成，它们可以保护病毒RNA不被环境中的RNA酶降解；识别宿主细胞编码的位于细胞膜上的病毒受体；决定病毒宿主范围；决定感染的组织特异性。这4种结构蛋白分别由262、279、242、74个氨基酸组成。其中VP4蛋白最小，埋于病毒粒子内部，与病毒基因组RNA相连。VP1、VP2、VP3蛋白位于病毒粒子的表面，连同VP4蛋白首先形成衣壳蛋白亚单位，进而形成五聚体，最后由12个五聚体形成完整的病毒衣壳。这些结构蛋白的性质决定了病毒粒子的物理性状及抗原性等。VP1蛋白空间结构中含有8个β片层结构和2个α螺旋结构，位于壳粒表面的环形结构与β片层相连，羧基端位于壳粒的外侧，氨基端位于内侧，这些末端与其他蛋白末端结合，使病毒衣壳更加稳定。PTV-8jilin/2003株的VP1蛋白由792个核苷酸编码264个氨基酸组成，VP1蛋白含有病毒主要的抗原位点和中和位点，主要决定病毒的抗原性。2007年Kaku等通过单克隆抗体预测了PTV衣壳蛋白结构，其中VP1蛋白的C末端突起结构、G-H环以及VP2突起结构决定了PTV抗原性，是主要的抗原表位，能够刺激机体产生中和抗体，同时还参与了细胞表面受体的识别和结合。

目前针对本病没有有效的治疗药物，只能以预防为主，同时采取综合性措施，防止易感猪群被PTV感染。在该病暴发初期，主要是采取患病猪或人工感染猪的组织脏器制成悬液，以氢氧化铝为佐剂制成的组织灭活苗。该疫苗在东欧地区应用后大大降低了该病的病死率，证明其具有良好的保护力，在该病的防治中发挥了重要作用，目前国内还没有针对PTV的疫苗。猪捷申病毒脑脊髓炎已很少发生，而且有些国家早已扑灭了该病，对PTV的研究已处于停滞状态，但不能排除在猪群中呈隐性感染的PTV毒株在长期的自然选择和变异的过程中出现毒力增强，重新暴发大流行的可能性，所以必须提高警惕，做好猪捷申病的防治工作。

由于弱毒苗存在安全性问题，灭活苗诱导免疫反应慢，近年来基因工程活载体疫苗开始得到广泛研究和应用。其中腺病毒作为活载体已广泛被用于疫苗研制，腺病毒作为载体有以下优点：基因组稳定，易于用重组DNA技术操作；安全性较好，腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中；插入大片段外源性基因的潜力大；宿主范围广，可感染分裂细胞和非分裂细胞；容易将外源基因直接导入靶细胞，并有效表达活性蛋白；外源基因表达水平较高。王先炜等构建了含PCV2 Cap基因的重组腺病毒，免疫小鼠后经中和试验、间接ELISA和Western blot鉴定，能产生针对PCV2的抗体，可以作为预防PCV2感染的候选疫苗。孙元等将猪瘟病毒E2蛋白基因插入到腺病毒载体中，成功包装出能高效表达E2蛋白的重组腺病毒，通过在兔子和猪体上进行免疫和攻毒试验，结果表明免疫重组腺病毒后能抵抗猪瘟强毒的攻击。因此，以腺病毒为载体的基因工程活载体疫苗能诱导有效的免疫反应。

发明内容

本发明目的之一是提供猪捷申病毒8型VP1（PTV-8VP1）蛋白的氨基酸序列及编码其的核苷酸序列；

本发明的目的之二在于提供一种含有PTV-8VP1基因序列的表达载体；

本发明目的之三是提供一种含有上述表达载体的宿主细胞；