[发明专利]影响奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3基因的核心启动子及其功能性分子标记与应用无效

专利信息
申请号: 201210257692.9 申请日: 2012-07-25
公开(公告)号: CN102899396A 公开(公告)日: 2013-01-30
发明(设计)人: 黄金明;王秀革;李黎明;鞠志花;齐超;张燕;李秋玲;王长法;李荣岭;杭苏琴;侯明海;高运东;仲跻峰 申请(专利权)人: 山东省农业科学院奶牛研究中心
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12N15/113;C12N15/11
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 250131 *** 国省代码: 山东;37
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 影响 奶牛 乳腺炎 抗性 hmgb3 基因 核心 启动子 及其 功能 分子 标记 应用
【权利要求书】:

1.一种改善种群奶牛的抗乳腺炎能力的方法,其特征在于:通过反转录RT-PCR和实时荧光定量RT-qPCR的方法提供一个奶牛乳腺炎易感/抗性HMGB3候选基因,同时为了深入研究HMGB3两个转录本的表达调控模式,利用在线软件分析发现牛HMGB3基因共有3个启动子区:P1、P2和P3,进一步通过构建载体、细胞转染、启动子活性测定和荧光强度测定实验发现了牛HMGB3基因3个启动子的核心区域,并且在第3个启动子P3的核心区域内发现了一个SNP,构建EGFP-HMGB3-P3载体,经293T细胞转染后,发现该SNP位点可影响启动子P3活性,属于功能性位点,利用该SNP与奶牛乳中体细胞评分SCS的关联分析表明该SNP与奶牛乳腺炎有关,选择有利的等位基因型个体留种,从而改善种群奶牛的抗乳腺炎能力。

2.一种影响奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心启动子区的鉴定方法,其特征在于通过实时反转录RT-PCR和荧光定量RT-qPCR的方法发现目的基因HMGB3在正常的和患乳腺炎的奶牛乳腺组织中mRNA存在差异表达;构建不同长度片段的pGL3-basic-HMGB3双荧光素酶报告基因载体,以及具有野生型和突变型碱基的pEGFP-N1-HMGB3载体,分别转染293T细胞,确定牛HMGB3基因的核心启动子区;通过对牛HMGB3基因核心启动子区进行直接测序分析,在HMGB3基因的第3启动子P3内发现一个单核苷酸突变g.+2690C>T,它位于潜在的转录因子结合位点上,可影响启动子P3的转录活性;通过奶牛群体基因型和乳中体细胞评分的关联分析,证明这个位点为功能性位点,且与奶牛乳腺炎相关。

3.一种实现影响奶牛乳腺炎易感/抗性的HMGB3基因核心启动子区的鉴定以及利用该鉴定改善种群奶牛的抗乳腺炎能力的方法,其特征在于该方法的步骤是:

a、筛选HMGB3基因作为奶牛乳腺炎易感/抗性候选基因

a.a RT-PCR检测HMGB3基因两个转录本在不同组织中的表达

提取患乳腺炎奶牛的乳腺组织样品和正常牛的不同组织样品的mRNA,反转录后用来分析HMGB3mRNA的相应组织的表达量,

利用RT-PCR定量的结果,反映转录本HMGB3-TV1和HMGB3-TV2的mRNA在各组织中的表达情况,来确定HMGB3基因与奶牛乳腺炎的关系;

a.b荧光定量RT-qPCR检测HMGB3基因在乳腺组织中的表达

为了进一步分析HMGB3的表达量和奶牛乳腺炎的关系,分别选择正常的和患乳腺炎的乳腺组织进行RT-qPCR,相对表达水平用管家基因β-actin做内参,每个样品重复实验,

分析荧光定量RT-qPCR的结果,比较患乳腺炎的组织HMGB3mRNA的表达量和其在正常奶牛乳腺组织的表达量;结果表明,患乳腺炎的组织HMGB3mRNA的表达显著高于其在正常奶牛乳腺组织的表达;

b、牛HMGB3基因启动子P1、P2、P3的克隆和活性分析

生物信息学genomatix软件预测发现牛HMGB3基因有3个启动子,为了进一步验证这3个启动子是否具有启动子活性,而且确定其核心启动子区,利用序列递减的方法对P1和P2启动子区不同片段构建入pGL3-basic载体并且转染293T细胞,进行双荧光素酶报告基因分析其不同片段的启动子活性,根据NCBI的牛HMGB3基因参考序列,构建pGL3-1、pGL3-2、pGL3-3、pGL3-4和pGL3-5载体验证分析HMGB3-P1启动子,构建pGL3-C-1和pGL3-C-2载体分析P2启动子,最终实验验证发现HMGB3基因的P1启动子核心区位于g.-655-g.-114,牛HMGB3基因的P2启动子核心区位于g.-116-g.+301区域;

c、HMGB3基因P3启动子区功能性SNP位点的鉴别

设计引物HMGB3F:SEQ ID NO.3和HMGB3R:SEQ ID NO.4扩增HMGB3启动子P3区,通过对DNA直接测序的方法,使用DNAStar软件包中的SeqMan软件分析测序结果,在P1和P2启动子区未发现SNP位点,但是在P3启动子区内发现了1个SNP位点,即在扩增片段的第454位发生碱基C>T突变,根据国际通用的SNP命名和编码规则,该SNP突变命名为g.+2690C>T,由于这个突变的引入消除了限制性内切核酸酶Sac II的结合位点,因此,Sac II限制性内切酶可将具有不同突变的PCR产物切成长度不同的片段,经2%的凝胶电泳后,TT基因型可分离出两个条带538bp和388bp,CT基因型可分离出四个条带538bp、388bp、347bp和191bp,CC基因型可分离出三个条带388bp、347bp和191bp;

基因组结构分析发现,启动子P3位于牛HMGB3基因的第三内含子中,与HMGB3转录本2相差7个碱基,结合牛HMGB3基因转录本2的基因表达结果,表明,启动子P3负责启动转录本2的转录,为了进一步研究该SNP(g.+2690C>T)对P3启动子的活性是否有影响,将序列包含C和T等位基因的g.+2253~g.+3035两个启动子片段分别构建入pEGFP-N1载体,命名为pEGFP-N1-P3-WT和pEGFP-N1-P3-MT,转染293T细胞24和48小时后,在荧光显微镜下观察其荧光强度,分析发现含有T等位基因的启动子片段活性高于含有C等位基因的片段活性,表明T等位基因片段具有更高的启动子活性,可促进HMGB3基因的转录,为进一步分析启动子P3的g.+2690C>T突变是否影响转录因子结合位点,用软件分析P3序列突变前后,转录因子结合位点,结果发现,C突变为T后,删除了1个转录因子E2F结合位点,导致了HMGB3基因启动子P3具有更强的启动子活性;

选择HMGB3基因序列上P3启动子鉴别到的SNP位点在302头中国荷斯坦奶牛个体中,对SNP进行酶切基因分型,采用SAS8.1软件进行关联性分析,发现TT基因型个体的SCS显著低于具有CC和CT基因型个体的SCS,表明HMGB3基因g.2690位点的TT基因型是乳腺炎抗性的有利基因型,可以在奶牛育种改良过程中作为候选基因的功能性分子标记,用于辅助选择具有更高乳腺炎抗性的个体,通过分子标记辅助选育乳腺炎抗性个体,从而培育出抗乳腺炎的优良种牛新品系。

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于山东省农业科学院奶牛研究中心,未经山东省农业科学院奶牛研究中心许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201210257692.9/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top