[发明专利]无损检测细胞miRNA的表达量及确定细胞类型与状态的方法

权利要求书

1.一种快速、简便、对细胞无损地检测细胞中miRNA的表达量和确定细胞类型与状态的方法，其是通过检测细胞培养基中的miRNA的表达量而实现的，所述培养基中miRNA表达量的检测通过包括以下步骤的方法进行：

1）收集过夜培养细胞的培养基，离心，取上清，再将其过滤；

2）用步骤1）获得的过滤后的上清液提取RNA；

3）将步骤2）提取的RNA进行逆转录反应，得到cDNA溶液；

4）将步骤3）得到的cDNA溶液进行PCR扩增反应，再用荧光定量PCR仪检测，从而得到其中miRNA的表达量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1）中，所述细胞选自人或动物胚胎成纤维细胞、人或动物诱导多能性干细胞、动物胚胎干细胞、人或动物成体干细胞、转分化来源的人或动物细胞、人或动物的分化细胞或肿瘤疾病细胞或疾病干细胞中的一种或多种；

优选地，所述动物诱导多能性干细胞选自2N-iPS细胞和4N-iPS细胞，更优选地，所述2N-iPS细胞包括细胞系IP20D-3和IP36D-3，所述4N-iPS细胞包括细胞系IP14D-1、IP14D-6、IP16DT-2A和IP14DN-5；

优选地，所述动物胚胎干细胞为ESC2和/或CL11；

优选地，所述动物胚胎成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞；

优选地，人或动物的分化细胞选自动物尾尖细胞和/或小鼠神经前体细胞，更优选地，所述动物尾尖细胞为小鼠尾尖细胞；所述神经前体细胞为小鼠神经前体细胞；

优选地，所述肿瘤细胞为人乳腺癌细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1）中，当所述细胞为小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠尾尖细胞或人乳腺癌细胞时，所述培养细胞的培养基为450ml DMEM加入50ml FBS，5ml 100x青链霉素的培养基；或

当所述细胞为小鼠神经前体细胞时，所述培养细胞的培养基为添加有EGF和bFGF的N2B27培养基，优选地，所述EGF和bFGF的浓度均为20ng/ml；或

当所述细胞为小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS诱导多能性干细胞时，所述培养细胞的培养基为含15%FBS的DMEM培养基，优选地，所述DMEM培养基中还添加有1000U的白血病抑制因子、2mM的谷氨酰胺、1mM的丙酮酸钠、0.1mM的β-巯基乙醇和0.1mM的非必需氨基酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤4）中，所述PCR扩增反应的上游引物为miRNA特异扩增的上游引物，所述下游引物为通用引物，优选地，所述通用引物为商品名AOMD-Q050，GeneCopoeia的通用引物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述miRNA的特异扩增的上游引物为miRNA-292-3P、miRNA-294-3P、miRNA-323-3P或miRNA-21-5P的特异扩增的上游引物；优选地，所述miRNA-292-3P的特异扩增的上游引物为商品名为MmiRQP0944，GeneCopoeia的引物，优选地，所述miRNA-294-3P的特异扩增的上游引物为商品名为MmiRQP0947，GeneCopoeia的引物，优选地，所述miRNA-323-3P的特异扩增的上游引物为商品名为MmiRQP0410，GeneCopoeia的引物，优选地，所述miRNA-21-5P的特异扩增的上游引物为HmiRQP0316，GeneCopoeia的引物。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1）通过包括以下步骤的方法进行：收集过夜培养细胞的培养基5-10ml，于2000-3000rpm离心，取上清，再将其用0.45μm的过滤器过滤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤1）中，收集过夜培养细胞的培养基5ml，于2000rpm离心。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤2）中，用TRIZOL LS试剂提取RNA。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤3）中，用All-in-OneTMmiRNA反转录试剂盒进行逆转录反应。