[发明专利]可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸适配体及其筛选和应用，尤其涉及一种可用于检测人肝癌细胞的核酸适体及其筛选方法和应用。

背景技术

核酸适体（aptamer）是通过指数富集配基的系统进化技术（SELEX）筛选得到的，能特异结合靶物质的单链寡聚核苷酸（ssDNA或ssRNA）。核酸适体与抗体功能类似，但是与抗体相比具有更多的优势，具有更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够化学合成，成本低；可进行标记；稳定性好，易于保存等优点。核酸适体的靶分子更为广泛，包括金属离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质，并从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。因此，核酸适体具有广泛的应用前景。

肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌，原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。全世界每年新发肝癌患者约60万，居恶性肿瘤的第五位。对于恶性肿瘤而言，如果能及早发现、尽早治疗，则癌症的病情往往容易得到控制，降低肝癌发病引起的死亡风险。因此，开发一种更加灵敏、简便、高效和具有特异性的肝癌检测手段，对于肝癌的临床治疗将具有十分重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体及其衍生物，还提供前述核酸适体的筛选方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下序列1～序列4中的任意一条序列所示的DNA片段：

序列1：

5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATAAACGGTCACCCGAGTAGAGGGTATGGACTTCGA

CGTATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；

序列2：

5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAATGGAATGTGGGAGGGGGACTCAGGACAGTCACG

GGACATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；

序列3：

5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGAGGACCCCAGGGTATGGACTTCGACGTCTGAGGT

CATCTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’；

序列4：

5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAAAGTTCAACAAGTGGGAGGGGGACTTAGGACAGT

CATCTTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’。

上述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上的某一位置可优选被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。

上述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上优选结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。

以上不论是经部分取代或者经过修饰后的核苷酸序列，都具有原核酸适体基本相同的性质和功能，即都可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种：

（1）与上述所列核酸适体的核苷酸序列的同源性在60%以上；

（2）与上述所列核酸适体的核苷酸序列进行杂交的序列；或者

（3）上述所列核酸适体的核苷酸序列转录的RNA序列。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体衍生物，所述衍生物是上述所列核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。

以上不论是衍生出的核酸适体还是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸适体基本相同的性质和功能，即都可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤：

（1）合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：

随机文库RS40：5’-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA(40N)TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA

5’引物：5’-FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3’

3’引物：5’-Biotin-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3’；