[发明专利]人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白表达系统，尤其涉及一种人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统。

背景技术

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近些年来一个较为成功的外源蛋白真核表达系统，与大肠杆菌表达系统相比，它能更好地表达结构复杂的蛋白质，并且能够完成如二硫键形成这样的翻译后修饰。与哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统相比，它具有操作简单、表达量高、容易产业化放大等优势。

白介素1受体拮抗剂(Interleukin 1 receptor antagonist，IL1ra)，是一种可与IL1受体结合的蛋白，当其与IL1受体结合后可阻断IL1的生物学活性。因此一定浓度的IL1ra能使这两个细胞因子在生理学和病理生理学以及炎症反应中的生物学活性被中和。2001年11月14日美国FDA正式公布批准美国Amgen公司生产的商品名为Kineret的重组(rh-)IL1ra用于治疗类风湿性关节炎，批准适应症为“18岁以上的中度和严重的类风湿性关节炎患者，在使用一种或多种改善疾病的抗风湿药物后失效时，明显减轻病人的体征和症状”。

由于IL1ra分子量只有17kDa，易被肾小球滤过，因而在临床治疗时，血药半衰期较短，一般需要大剂量频繁用药，如100mg/day。为了提高重组IL1ra在体内的血药时间，中国专利200810060568.7利用基因工程手段将其与HSA融合后插入毕赤酵母中并表达，经融合后的蛋白(IGH)在小鼠体内血药半衰期显著提高，但该融合蛋白基因在毕赤酵母中为单拷贝，蛋白表达量不够高。

发明内容

本发明提供了一种人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统，以解决现有表达系统融合蛋白表达量不高的问题。

一种人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统，包括宿主细胞和转化入宿主细胞的表达载体，所述表达载体包括插入有融合蛋白基因的第一表达载体和插入有二硫键异构酶基因的第二表达载体，所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介素1受体拮抗剂基因，所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。

二硫键异构酶(PDI)是硫氧化还原酶家族中的一种，主要功能是在内质网上催化新合成的蛋白形成正确的二硫键。在毕赤酵母的内质网上有一套严格的质量控制体系，只有形成正确结构的蛋白才能从内质网分泌到高尔基体当中。如果蛋白没有形成正确的结构，则会被降解或积聚在内质网上，最终降低该蛋白的表达。IGH融合蛋白中含有18对二硫键，更多的PDI可以帮助融合蛋白形成正确的二硫键，以提高表达量。

在第一表达载体中包含IGH融合蛋白基因为目的基因，它插入在启动子的下游，在第二表达载体中包含二硫键异构酶基因为目的基因，它同样插入在启动子的下游。

在第一表达载体中，人血清白蛋白基因和白介素1受体拮抗剂基因可以直接连接，也可以通过连接肽序列连接，所述连接肽序列是指编码连接肽的DNA序列，连接肽用于连接人血清白蛋白和白介素1受体拮抗剂。该连接肽的氨基酸残基序列可以由甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸中的一种或多种连接组成，具体可以为[GGGS]_n，n为不大于4的自然数。在融合蛋白基因中，人血清白蛋白基因和白介素1受体拮抗剂基因两者之间的相对位置是任意的。所述融合蛋白基因还包括限制性酶切位点，使得酶切后可以产生粘性末端，便于基因序列的连接。关于融合蛋白的基因结构可以参考中国专利200810060568.7公开的内容。

所述第一表达载体和第二表达载体为真核表达载体，优选的，所述第一表达载体包含信号肽，所述第二表达载体不包含信号肽，如此融合蛋白可以分泌到胞外，而PDI可以存留在胞内，便于融合蛋白的分离纯化。更优选的，所述第一表达载体和第二表达载体的原始载体优选为pPIC系列载体，其中第一表达载体的原始载体优选为pPICZαB，第二表达载体的原始载体优选为pPIC3.5K。

在本发明中第一表达载体可以为单拷贝，但为了提高表达量，最好选用为多拷贝，拷贝数至少为2个，优选为3～4个。

本发明还提供所述表达系统的构建方法，包括：

(a)用限制性内切酶将融合蛋白基因(IGH基因)从pPIC9-IGH上切下并回收；

(b)将步骤(a)中得到的IGH基因插入到pPICZαB相应的酶切位点中；