[发明专利]一种高效表达重组人凝血八因子的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用哺乳动物细胞培养高效表达重组八因子的工艺方法。

背景技术

天然人凝血八因子（FVIII）是一种大分子糖蛋白，由重链和轻链结合而成，总分子量330KD，血浆中含量约0.2mg/L，以结合血管性血友病因子（VWF）的形式存在。血液凝集反应中，活化的FVIII使FIX的酶活大大提高，催化FX的活化，并结合组成一个复合体，催化凝集链式反应进行下去。FVIII分子的缺失或缺乏导致A型血友病，补充有活性的FVIII是治疗A型血友病的有效措施。

重组人FVIII与天然FVIII有相同的生理，药理和免疫特征，并且有杜绝HIV，HDV，蛋白病毒等病源传播的优点，因此，重组FVIII蛋白表达的研究成为A型血友病治疗的一个重要趋势。世界上第一支重组人凝血八因子，即第一代的重组八因子在1990年就已经上市。目前全球的八因子销售年达到了70亿国际单位，其中60%为基因工程重组凝血八因子。

天然FVIII总是与vWF结合成复合物而稳定存在。重组FVIII分泌至细胞的无血清培养基时，分子很容易解体，并且被降解，表达的FVIII得不到积累。利用vWF和FVIII共表达系统可以很好地解决重组FVIII在细胞分泌表达过程中的不稳定和容易降解等问题。Kaufman等人的研究表明，FVIII与VWF共表达后可显著提高FVIII的表达水平。此外，在有血清的培养条件下，血清中的VWF可以结合新生成的VIII，形成比较稳定的复合物，达到FVIII在细胞培养液中累积的效果。

在利用细胞大规模培养来生产重组八因子过程中，为了提高八因子的表达量，利用有血清培养基或者在哺乳动物细胞中共转染FVIII和VWF基因，稳定了八因子的表达，但这两种方法都存在各自的局限性。对于有血清培养基来说，由于在哺乳动物细胞培养过程中，外源添加动物血清而带来了病毒潜在污染的风险。因此，目前利用哺乳动物细胞生产蛋白质药物中倾向于无血清培养替代有血清细胞培养。而对于VWF与FVIII基因的共表达来说，人们在研究重组人凝血八因子表达中发现，VWF与FVIII共表达，八因子的表达量比较低，细胞株的构建也比较复杂，筛选出的高表达八因子细胞株在无血清培养基中的表达量一般在0.1-0.5国际单位/天/10⁶细胞，此表达水平远远达不到产业化的要求。可见，目前急需一种新的培养方法来表达重组八因子，能够在无血清培养条件下实现重组八因子的工业化生产，使八因子的表达简单、高效、无病毒污染。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用哺乳动物细胞培养高效表达重组八因子的工艺方法。

本发明首先公开了一种高效表达重组人凝血八因子的方法，为将外源的血管性血友病因子添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中，并在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为1～10:1。

较优的，所述表达重组人凝血八因子的细胞培养液为无血清细胞培养液。

本发明中所述表达重组人凝血八因子的细胞为单独表达重组FVIII的细胞株，VWF为另外制备，作为分子伴侣额外添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中的外源物质。

本发明提供的技术方案是将VWF按照一定的比例添加到重组八因子的细胞培养液中，可大大提高重组八因子的表达量，这种方法为工业化八因子的生产提供了一种简单实用的实现路径。本发明的方法不需将八因子和VWF基因共转染宿主细胞，简化了细胞株构建过程，提高了高产细胞株筛选效率，特别适合工业化大规模生产重组人凝血八因子。

较优的，所述高效表达重组人凝血八因子的方法具体步骤如下：

1）表达细胞的准备：表达人凝血八因子的细胞株的构建或者表达人凝血八因子的冻存细胞的复苏；

2）表达细胞的扩种培养：将步骤1）构建或复苏的人凝血八因子表达细胞接种到无血清培养基中，振荡培养3～4天，至细胞密度达到1～2×10⁶cells/ml，细胞传代，振荡培扩增养至细胞密度达到1～2×10⁶cells/ml，获得种子液；

3）细胞反应器培养：将步骤2）获得的种子液接种到细胞反应器的无血清培养基中，培养4～7天，使细胞液的细胞密度达到1～5×10⁶cells/ml；然后向细胞液中加入外源VWF并对细胞液进行补料培养，获得细胞原液；所述补料培养过程中，控制细胞液中VWF活性与FVIII活性比为1～10:1；