[发明专利]一种通用型检测汉坦病毒实时荧光RT-PCR的非诊断性方法

说明书

技术领域

本发明提供一种利用荧光定量RT-PCR检测汉坦病毒的非诊断性方法。 

背景技术

汉坦病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）的汉坦病毒属（Hantavirus），为分节段的单股负链RNA病毒，其基因组由大（L）、中（M）和小（S）3个基因片段组成，分别编码依赖RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白Gn、Gc以及核蛋白。汉坦病毒的基因型别较多，截止目前已发现40多种。汉坦病毒引起人类肾综合征出血热和人类肺综合征出血热。 

随着全球经济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和国际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传播。传染病在国际间的广泛传播与流行，已成为各国政府密切关注的政治问题。《国际卫生条例》、《中华人民共和国卫生检疫法》都对传染病风险预警与快速决策做出了相应的规定。我国尤其是在边境口岸应对一些未知病原的袭击或传入，基本不具备发现和控制的能力。这种缺陷突出表现在缺乏先进的分型技术、分子溯源技术及快速检出技术，难于在短时间内建立正确的应对措施。这种状况下，在我国国境口岸病原体宿主之间的交流机会加速了汉坦病毒基因组的微进化，一旦这种进化朝着有利的方向发展，很可能使缺乏普遍相应免疫力的人群感染并迅速传播，从而引起汉坦病毒的广泛流行。鉴于汉坦病毒流行态势的复杂性、汉坦病毒的基因多态性、病毒寄生宿主的多样性，使得建立一种通用检测鉴别技术成为必要。 

目前，针对外来疫病的实验室快速检测技术主要采用的是免疫学检测及核酸检测技术，尤其是以PCR技术为代表的核酸检测技术，能够非常灵敏的检测到各种疫病病原体。近年来，随着实时荧光PCR技术的广范应用，使得病原体的检测得到飞速的发展。目前，尚无汉坦病毒的通用性检测方法，基本上都是以每一种汉坦基因型别为基础单一的扩增对应的型别。本发明拟采用实时荧光PCR技术，利用一对引物及一条探针检测不同基因型别的汉 坦病毒，使之成为应对国内汉坦病毒型别或外来汉坦病毒型别传入我国的有力武器，保障人民群众的生命安全和国家的卫生安全。 

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高的检测汉坦病毒的荧光定量PCR非诊断性方法。 

为实现上述目的，本发明一种通用型检测汉坦病毒实时荧光RT-PCR的非诊断性方法，该非诊断性方法包括: 

（1）选择汉坦病毒L基因全长序列，进行同源性比对，在其保守区设计引物； 

（2）根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性探针，并检测探针的特异性； 

（3）对待检测物进行实时定量分析； 

其中，针对汉坦病毒L基因全长序列设计引物和探针为： 

进一步，所述引物和探针参数信息为： 

进一步，所述探针HV Universal Probe L的5’端所标记荧光基团为FAM或CY3，探针3’端连接的淬灭基团为BHQ1或TAMARA。 

进一步，所述非诊断性方法包括步骤： 

1）提取待检测样本的RNA； 

2）实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25μL PCR反应体系，混匀后短暂离心分装到PCR管中; 

3）将待测样品加入到反应体系中，进行扩增； 

4）在退火阶段收集荧光信号，检测Ct值。 

进一步，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下： 

扩增条件： 

进一步，所述实时荧光RT-PCR反应可使用的仪器为ABI实时PCR系统：7000、7300、7500或7900；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪MX4000、MX3000或MX3005。 

本发明的有益效果在于：汉坦病毒实时PCR检测方法利用特异性荧光探针，实行完全闭管式操作，大大减少了扩增产物污染的机会、减少了实验步骤、实验时间和对试剂的消耗，不同于常规PCR，无需电泳鉴定。目前尚无汉坦病毒的通用性检测方法，基本上都是以每一种汉坦基因型别为基础单一的扩增对应的型别。本发明实现了利用一对引物及一条探针检测不同基因型别的汉坦病毒，实时PCR具有非常高的灵敏度和特异度，对汉坦病毒基因非常灵敏、准确。在实际中，尤其是疫情爆发时有很高的应用价值。 

附图说明