[发明专利]一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物药用原料的制备纯化方法，属于生物工程领域，具体是一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺。

背景技术

肝素钠是一种富含阴离子的粘多糖硫酸酯，由动物体内的肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生，因最初从肝脏中提取，故名肝素。临床使用的肝素是从动物肠、肺粘膜、血管壁等处提取获得的钠（锂）盐，肝素钠（锂）具有抗凝血、抗炎、抗癌等多种生物学功能，但长期使用会有诸如出血、骨折等负作用。20世纪80年代初期发现低分子肝素钠（LMWH，<8000Da）具有更强的活性和较小负作用，成为主要的临床抗凝血药。

目前国外已有10多种LMWH相继问世，全球四大制药企业均有该类产品的销售，我国是主要的肝素原料国，产量约占全球的一半。应用于临床的LMWH是由普通肝素为原料制备获得,制备方法主要有生物酶法、化学裂解法两种。它们各有优势，肝素酶降解反应条件温和、专一性高、副产物少而且引入一个紫外生色团，检测方便，但酶的价格昂贵，难以跨越工业生产的界线。化学裂解法不可避免的会改变肝素钠的结构、影响活性等。中国专利（授权号CN1096034）公开了一种纯化的肝素裂分其制备方法和含有它们的药物组合物。纯化的肝素裂分通过如下步骤制备：向肝素钠中加入亚硝酸盐，pH1～5处理20～50分钟，再在碱介质中以硼氢化钠还原，用HCL破坏过量硼氢化钠并用乙醇沉淀分级，将得到的溶液暴露在紫外照射系统下，温度为5℃～50℃,pH为3～8，色谱纯化，最后用氯化钠和乙醇沉淀分离得降解肝素钠。美国专利（公开号3099600）公开了一种色谱技术分离纯化肝素钠的方法：将肝素钠粗品溶于缓冲溶液中，加入5～12倍肝素钠重量的离子交换树脂TEAM-cel lulose或DEAE-cellulose，后用缓冲液洗涤，盐洗脱，乙醇沉淀、干燥得产品。上述方法为工业上典型的制备及纯化肝素钠的过程，生产工艺复杂、成本高，而且没有提及对肝素钠的结构类似物多硫酸软骨素这一主要杂质的去除方法。

发明内容

本发明的目的为了改进现有技术的不足而提供一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺；该发明提供一种简便的低分子肝素钠制备、纯化技术，制得的低分子肝素钠平均分子质量在4.5KDa左右，效价不低于180U/mg,高于中国药典要求的170U/mg，且依据中国药典肝素钠检测标准检测合格。

本发明的技术方案为：一种制备高纯度低分子肝素钠的工艺，其具体步骤如下：

（1）将粗品肝素钠溶于NaCl溶液中，机械搅拌至肝素钠全部溶解，向溶液中加入碱液直至产生沉淀，静置，过滤除去不溶物，得滤液；

（2）将步骤（1）中滤液以碱液调pH至9.5～10.5，加入H₂O₂溶液，在10～30℃下反应2.5～3.5小时，得反应液；

（3）将步骤（2）得到的反应液升温至30～50℃，此后每隔2.5～3.5小时补加H₂O₂溶液，并调节pH；补料后共反应15～21h；

（4）向步骤（3）得到的反应液中加入吸附剂，磁力搅拌，过滤除不溶物，得滤液；

（5）将步骤（4）中的滤液通过平衡好的凝胶色谱柱，收集低分子量的肝素钠洗脱液；

（6）将步骤（5）中的低分子量的肝素钠洗脱液用弱碱性离子交换树脂吸附，分别以三种浓度的NaCl溶液洗脱，收集第一种（最低）、第三种（最高）浓度的NaCl洗脱液并混合；

（7）将步骤（6）中的混合洗脱液，在磁力搅拌下降温至－5～8℃，再用乙醇沉淀、真空干燥得产品。

优选步骤（1）中NaCl溶液的质量百分浓度为1.2～1.8%；NaCl溶液的用量为2～3mL/g肝素钠粗品量；静置时间1～2小时；优选步骤（1）和（2）的碱液均为NaOH或KOH溶液；碱液的浓度为1～1.5mol/L。

优选步骤（2）和（3）中所加入的H₂O₂溶液和NaCl溶液的体积比为3～5：100；步骤（2）中H₂O₂溶液的浓度为1～5mol/L，步骤（3）中H₂O₂溶液的浓度为1～3mol/L。步骤（3）中每次补加完H₂O₂溶液后测定pH，使pH在6.8～7.5之间。

优选步骤（4）中所述的吸附剂为活性碳、皂土或硅酸盐；吸附剂的加入量为3～5g/100mlNaCl溶液量。