[发明专利]细胞穿膜肽hPP10的生产及其介导质粒DNA转染的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体讲，涉及一种新型人源性细胞穿膜肽hPP10的生产及其介导质粒DNA转染的方法。

背景技术

随着人类基因组计划的完成和蛋白质组学的兴起，人们发现越来越多的生物分子比如蛋白质、多肽、核酸等均有可能成为治疗药物。但是与传统药物不同的是，这些治疗分子在体内稳定性低、需要在胞内发挥功能的分子难以进入细胞，因而会限制其作为药物的推广应用。故开发能有效携带这些治疗性生物大分子进入靶细胞、经济、安全的载体系统是亟需解决的问题。

近年来，非病毒药物运输载体以其安全性、低毒性、低免疫反应等优点被寄予厚望。迄今比较常用的生物大分子细胞内导入方式有如电穿孔、脂质体转染和有机高分子纳米颗粒等可能存在着安全隐患如对细胞的毒性作用、胞内释放困难、难于组装及操作和用于体内等这样那样的缺点。因此寻找新型的理想的非病毒药物输送系统引起了学者们的广泛兴趣（图18）。

在过去的20多年间，将核酸、多肽、蛋白等具有治疗作用的生物活性大分子跨膜转运入细胞内的技术取得了突破性进展。国内外学者在对一些病毒感染特性的研究中相继发现了一类蛋白结构域，如：HIV-1 Tat（48～60）、VP22 (267～300)，以及果蝇蛋白ANTP（43～58）等具有介导异源蛋白、寡聚核酸、金属螯合物等生物活性大分子直接跨过细胞膜进入胞浆和核内的功能，这一类富含阳离子、具有穿膜功能的短肽被称之为细胞膜穿透肽（cell-penetrating peptides，CPPs）、穿膜肽或蛋白转导域（proteintransduction domains，PTDs）。1988年Green和Frankel等首次发现TAT——人免疫缺陷病毒（HIV）的转录调节蛋白可以穿透细胞膜/核膜进入细胞浆/细胞核，随后的研究发现，该蛋白第48-60位氨基酸残基（YGRKKRRQRRR）形成的肽段即可完全发挥其穿膜功能。以后又相继发现了多个源自病毒或其他生物的CPP，如I型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1,HSV-1）蛋白的VP22、果蝇同源触角蛋白（drosophila hemeoprotein antennapedia transcription protein,ANTP）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的前S抗原等。依据其来源不同可将已经发现的CPP大致分为两类：一类为如上面提及的TAT、VP22、ANTP和前S抗原来源于病毒的短肽等；另一类为根据天然CPPs的特点人工合成的短肽如多聚精氨酸、MPG、PEP-1、MAP、transportan和各种基于不同信号序列合成的肽段等。CPPs能在体外或体内作为载药多肽，介导一系列生物活性分子如DNA、siRNA、多肽、蛋白质甚至纳米颗粒等进入细胞，发挥各自的生物学效应。这些CPPs因基本无毒副作用、不干扰所携带生物大分子活性，而被广泛用于体外或/和体内向细胞内运送生物活性分子，尤其是在抗肿瘤治疗的应用研究方面更是引人注目。CPPs研究在基础生物学和应用研究上都具有极大意义，作为一种有效的胞内运载工具，有着广泛的应用前景（图19）。

然而来源于病毒或其他种属生物蛋白结构域的CPP，在临床应用上可能仍然存在一定的安全隐患，比如可能的细胞毒性和免疫原性问题。人们对TAT作为CPP进行了大量研究，腹腔注射Tat-β-半乳糖苷酶，能进入小鼠各种脏器组织，甚至可以透过血脑屏障进入脑组织。但由于TAT源于HIV病毒蛋白而恐存有安全忧患，一直未能用于临床研究。另有报道称，应用TAT携带药物的上呼吸道喷雾引发了严重的肺部病理反应。可见，针对不同治疗需要，开发更为安全的、新型穿膜肽－－人源性穿膜肽（hCPP）是非常必要的。

2002年，Beck-Sickinger AG小组开创性地发现了第一个人源性穿膜肽－来源于人降血钙素（hCT）的第9-32的残基。随后相继报道的人源性穿膜肽还有来自于hCLOCK蛋白（一种与生物节律调节有关的蛋白，2004年）、Hph-1(一种人源转录因子，2006年)、Bag-1蛋白（一种可与Bcl-2相互作用的激活糖皮质激素受体的蛋白，2006年）、p14ARF蛋白（一种人抑癌基因蛋白，2008年）、人乳铁蛋白（2009年）、人Cytc77-101及Cytc86-101（2010年）和TCTP蛋白（来源于人翻译控制肿瘤蛋白氨基末端10个氨基酸残基，2011年）的CPPs。与其他生物来源的CPPs相比，人源性CPPs引起人体的免疫反应的可能性比较小，潜在的不安全因素相对较少。因此，作为临床应用的药物分子载体有着更广阔的应用前景。