[发明专利]烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于一种植物保护技术，特别指一种烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法。

背景技术

在烟草漂浮育苗过程中，一段式育苗放盘培养后约50天或两段式育苗抛苗培养约10天，时常发生根系腐变，影响烟苗移栽成活率和其它病害的协同侵染。导致弃苗率高，造成育苗业主和植烟农户的经济损失。然而，烟草漂浮育苗中的根腐现象，现有技术尚未明确致腐的确切原因或致腐生物，未见有关检测致腐原因或生物的方法。所以目前尚不能对根腐机理进行系统的阐述，也没有相应的防控技术可供采用，造成烟草育苗过程中极大的损失。因此，研究开发对根腐致腐菌的检测和防治方法，进而探索根腐发生机理具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提出一种烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，该方法能够在漂浮育苗中烟苗出现根腐前或出现初期快速检测出致腐菌，针对育苗池液和根系组织中致腐菌的存在状况，采取预防和防控措施，减少或者避免根腐苗，提高成苗率，确保烟农育苗和烟草种植的正常生产， 以解决现有技术的不足。

本发明的上述目的通过如下手段实现：

一种烟草漂浮育苗根腐致腐菌的快速检测方法，其特征在于有如下操作步骤：

（一）建立比对标准

（1）制备LB培养基备用；

（2）分离和培养根腐组织中的菌体；

（3）利用革兰氏染色法和显微镜观察法确定培养皿中致腐菌生物学特性，建成比对标准；

（二）分离并培养出漂池液中细菌；

（三）革兰氏染色法观察、比对培养皿所得漂池液菌落，根据上述对比标准鉴别，得漂池液中根腐致腐菌的定性定量检测结果。

上述LB培养基可以这样制备：Trypton LP0042(OXOID)-10g；Yeast Extract LP0021(OXOID)-5g； NaCl (AR)-5g；加蒸馏水至1000ml；溶解后调pH至7.2，固体培养基中加入2%的琼脂粉，分装至500ml的三角瓶中，121℃灭菌20min，备用。

上述根腐组织中菌体的分离和培养可以这样进行：(a)用消过毒的剪刀和镊子取根腐组织，在灭菌水中漂洗3次，置于0.1%的HgCl₂溶液中2分钟，取出消过毒的根腐组织，在灭菌水中漂洗3次；(b)将消过毒的根腐组织共选5株根系，剪成小段，每植株的根系2段，分别置于已制备好的LB平皿中，25℃培养箱中培养48小时。根系小段长为0.5cm。

漂池液中细菌的分离和培养可以这样进行：(1)取直径约9cm的培养皿60套，用报纸以10套/包进行包装，121℃灭菌20min，备用；

(2)在超净台上将熔化的LB培养基倒入灭菌的培养皿中，约15ml/皿，室温自然冷凝(54套)，按上述试验处理在每一皿上标号，备用；

(3)取30支试管，每支加入9ml蒸馏水，121℃灭菌20min，自然冷却至室温后按上述试验处理编号，备用；

(4)用装有灭菌水试管将漂池液样品依次稀释成10倍、100倍和1000倍，混匀，分别从稀释液中取0.2ml，按对应编号加入已制备的LB平皿中，用玻璃涂布棒涂匀；

(5)置上述平皿于25℃培养箱中培养48小时；

(6)取出培养皿，统计每一平皿上的菌落数(总数、不同颜色类群数量)，并换算成单位体积中菌体数量。

所述革兰氏染色法的过程是：(1)用滴管取无菌水，滴一滴水于载玻片中央，用接种环从平皿中培养物挑取菌落，涂于水滴中，将载玻片底部略靠近酒精灯火焰，烘干载玻片上的涂液；

(2)用革兰氏染色液对涂抹菌体进行染色；

(3)用滴管中蒸馏水将载玻片上的染色液洗去；

(4)置载玻片于光学显微镜的油镜下观察染色反应的结果，包括观察菌体大小和形态，并以图片和相关描述记录。

根据上述方法确定的烟草根腐致腐菌一组比对标准的生物学特性是：