[发明专利]小鼠肝窦内皮细胞的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小鼠肝细胞的提取方法，具体地指一种小鼠肝窦内皮细胞的提取方法。

背景技术

肝窦内皮细胞(Liver Sinusoidal Endothelial Cells）属于肝脏中的非实质性细胞，在肝脏中起到屏障、物质代谢、超滤内吞，抗原呈递等作用。近年来国内外学者对肝窦内皮细胞分离方法进行了大量的研究，但要获得纯度高，细胞活性好，功能稳定的肝窦内皮细胞仍很困难，尤其是小鼠肝窦内皮细胞。由于小鼠品系丰富,可以更充分的满足各类研究的需要，所以获得细胞活性好的小鼠肝窦内皮细胞具有重要意义。

目前，小鼠肝窦内皮细胞采用以下三种提取方法：两步原位灌流结合密度梯度离心法、机械分离结合酶消化及密度离心法、免疫磁珠分选及流式分选法。两步原位灌流结合密度梯度离心法主要集中于大鼠，由于技术条件的限制，较少应用于小鼠的肝窦内皮细胞分离，且该方法无法将肝窦内皮细胞和枯否细胞(kupffer cells)分离，导致最终获得的细胞纯度受到影响；机械分离结合酶消化及密度离心法对细胞损伤过大，而且会造成组织块表面消化过度，内部消化不足；免疫磁珠分选及流式分选法所得到的小鼠肝窦内皮细胞虽然纯度高，但是由于肝窦内皮细胞缺乏特异性的表面标志物，使得细胞获得量少，且细胞分选前必须加上某些化学标记有可能造成细胞的分化或凋亡，同时其昂贵的仪器及试剂费用限制了其在各个实验室的应用。

综上所述，现有的三种小鼠肝窦内皮细胞提取方法均有各自的缺陷，现有技术尚未报道有合适的针对小鼠的肝窦内皮细胞提取方法。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术针对小鼠肝窦内皮细胞分离时易产生机械损伤，化学预处理导致的细胞活力差，状态下降及纯度不够等缺陷，提供一种能够较好的保持细胞完整性和生化活性，且一次提取的肝窦内皮细胞数量较多，纯度高小鼠肝窦内皮细胞的提取方法。

为实现上述目的，本发明所设计的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，包括以下步骤： 

1）选取小鼠尾静脉注射氯化钆溶液，氯化钆的日注射量和小鼠体重之比为10~20mg/25g，连续注射两日后进行手术，术前一天禁食；

2）消毒器械及动物工作台，36~38℃预温D-hanks液，1640培养液及胶原酶IV溶液； 

3）选取小鼠腹腔注射戊巴比妥钠及肝素钠，戊巴比妥钠的日注射量和小鼠体重之比为40~100mg/kg，肝素钠40~60U/只；

4）待小鼠完全麻醉后固定于动物手术台，消毒小鼠腹部，无菌纱布铺巾防止污染；

5）取正中切口进腹，撑开腹腔，将肠管拨向左下腹，暴露门静脉及下腔静脉；

6）连接五十毫升注射器、灌注泵、延长管及静脉留置针，开启灌注泵，让预温的D-hanks液充满延长管及静脉留置针，排净空气；

7）静脉留置针穿刺门静脉，成功后拔出针芯，双重丝线结扎，D-hanks液被泵入门静脉，观察到肝脏颜色变成土黄色时，剪开下腔静脉，调整灌流速度为30ml/h；

8）依次剪开肝脏周围韧带及膈肌，将肝脏迅速完整的分离下来，勿损伤肝脏，将其置于预先放置了36~38℃D-hanks液的培养皿中，持续D-hanks液灌注25~40min；

9）然后，将灌流液体换为预温的胶原酶IV溶液，调整灌流速度为15~17ml/h，灌流20~30min后，拔出静脉留置针，将肝脏置于胶原酶IV溶液中于37℃温箱放置10~20min； 

10）从温箱中取出肝脏，将肝脏置于100目滤网上，减去胆囊及与肝脏相连的膈肌、韧带、肝门区血管，无损伤镊剥离肝包膜，挑去其中脉管系统，用预温的1640培养液反复冲洗将细胞滤过滤网； 

11）过滤后的细胞悬液低速50g离心3min，使肝脏实质性细胞沉淀，取上清液以800g离心10min后，取细胞沉淀以3毫升1640培养液重悬，得细胞悬液备用；

12）在离心管中，分别铺3ml的50%percoll溶液，3ml的25%percoll溶液，及3ml细胞悬液，常温离心1200g，20~40min； 

13）取两层percoll液体之间的细胞层，用1640培养液重悬混匀后，2000rmp离心10min，去掉上清，所得沉淀用1640培养液重悬并同样条件再离心一次，取沉淀得到待培养细胞，在体积百分比浓度为20%的胎牛血清中培养；

14）观察待培养细胞的贴壁状态，待细胞贴壁1小时后，取未贴壁细胞悬液于新容器中培养，12小时后换液，去除未贴壁细胞及死亡细胞，即为肝窦内皮细胞；