[发明专利]一种视网膜祖细胞培养方法及其培养基

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种细胞培养方法及培养基。

背景技术

视网膜退行性疾病是当今全球主要致盲性疾病，该类疾病如视网膜色素变性（RP）和年龄相关性黄斑变性（AMD）的主要特征是视网膜感光细胞死亡。由于人类视网膜细胞属于神经细胞，没有再生能力，所以目前最有效的治疗方法是替代或修复受损的视网膜感光细胞。

过去的几十年，在医药再生领域应用干/祖细胞移植方法诱导组织重建和功能再生已经吸引人们广泛的兴趣，特别是在视网膜再生领域已经取得了很多令人为之兴奋的成果。2004年科学家研究发现将视网膜祖细胞移植到受损的动物模型眼中后，这些移植的细胞可以形成成熟的视网膜神经细胞，包括视网膜节细胞和感光细胞等，并且可以迁移到受损细胞周围，一定程度的修复和替代受损细胞。视网膜祖细胞具有较成体细胞具有较强的增殖和分化潜能，免疫原性极低，无致瘤性，且来源于特定的组织减少了分化的问题，所以成为理想的再生医学领域内的种子细胞。

传统的视网膜祖细胞培养技术采用的是二维贴壁法，其与细胞生长的天然状态不同，不符合细胞体内生存环境，因而细胞的生长繁殖速度、基因表达、信号传导和形态学都可能与天然有异，且其常用的细胞外基质材料是纤维蛋白。纤维蛋白来源于患者自身的血浆中，其采集过程给患者造成痛苦，且可能由于血浆的大量流失导致患者出现身体疾病。应用异体来源或动物来源的纤维蛋白培养细胞都会造成外源物质的污染，且实验成本高，又难于满足临床和科研的广泛推广应用。传统的视网膜祖细胞用无血清培养基培养易导致细胞产量小，胎牛血清培养基由于含有异源成份不能满足临床的需要。

发明内容

为了克服现有技术的上述问题，本发明提供一种细胞培养方法，包含以下步骤：

步骤1：取海藻酸钠粉末与溶剂混合，混合均匀加热制成海藻酸钠凝胶，灭菌备用；

步骤2：收集成球培养的细胞，离心取沉淀，用培养基混匀细胞，种植在铺有海藻酸钠凝胶的细胞培养装置中进行培养；

所述培养基配方为DMEM/F12培养液，添加终浓度为1∶100的N-2添加物，终浓度为10-20ng/ml的表皮生长因子EGF，终浓度为10-20ng/ml碱性生长因子bFGF，终浓度为10-20ng/ml的三碘甲状腺氨酸T3、终浓度为10-20ng/ml的神经营养素NT4、终浓度为10-20ng/ml神经生长因子NGF、终浓度为10-20ng/ml神经营养物质-3NF3以及终浓度2mmol/l L-谷氨酰胺制成。

作为优选，所述细胞为视网膜祖细胞或神经干细胞。

本发明所述培养基为无血清无动物源性培养基，能够高效的促进视网膜细胞的生长和繁殖，防止细胞过早老化或分化。

海藻酸钠(C₅H₇O₄COONa)n是含在海带、海藻等褐藻类植物中的有机高分子电解物之一，与其它一些物质构成细胞膜的主要成份。海藻酸钠的化学成份属于碳水化合物，是海藻酸的钠盐，与淀粉、纤维素相比仅含有游离羧基（-COONa），从化学结构上看是由甘露糖醛酸和古罗糖醛酸共聚而成的一种链状高分子杂聚物。海藻酸钠为白色或淡黄色粉末，几乎无臭无味。海藻酸钠溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。溶于水成粘稠状液体，1％水溶液pH值为6-8。当pH＝6-9时粘性稳定，加热至80℃以上时则粘性降低。

海藻酸钠自身带有二价阴离子，在二价阳离子存在条件下可交联形成网状水凝胶，该凝胶为细胞的生长提供了三维空间，又因其具有较好的亲水性，营养物质易于渗透扩散，酶解产物对细胞无毒害作用，故非常适宜细胞生长需要。海藻酸钠凝胶具有三维网状空间结构，当细胞在这种材料中培养时可以有效的模拟体内细胞生长环境，能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，从而培养出的细胞更加接近体内真实环境的细胞。本发明所述细胞培养方法可以使贴壁或悬浮细胞生长在有一定三维空间结构的细胞外基质中，确保了高质量、高密度的细胞繁殖，突破了传统培养方法细胞产量小、质量差等局限性。

美国食品和药品监督管理局（FDA）要求治疗用细胞制品体外培养时间不应超过五周，传统的细胞培养方法培养到第五周时也很难得到满足临床需要的细胞量，应用三维培养方法，二周或三周可到的产量就远远满足于临床的需要。本发明所述细胞培养方法使细胞在三维空间内形成排列有序的细胞球，随着细胞的生长，细胞长成梭型，2周即可获得大量的细胞。通过实验证明，三维空间方法培养的细胞基因表达和自我增殖能力均未发生变化，细胞具有高效的向其它胚层分化的能力，同时易于外源基因的转染。