[发明专利]一种简单的磁颗粒功能化修饰方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说，涉及的是一种简单的磁颗粒功能化修饰方法。

背景技术

磁纳米和微米颗粒是一种在生物医学领域中有着重大应用价值的新型材料。磁颗粒的表面性质对其实际应用有着极其重要的影响。总体而言，磁颗粒通过表面功能化修饰起到如下三个方面的作用：（1）控制磁颗粒的尺寸和形貌；（2）赋予磁颗粒合适的表面官能团和胶体稳定性；（3）进行磁颗粒的生物学功能化。

在磁颗粒生物学功能化方面，针对不同的生物分子，如寡聚核苷酸、蛋白质（含抗原、抗体、酶）、多肽等，不同的修饰方法已经被用来对磁颗粒表面进行功能化修饰。比如，Fengqin Hu等人(Adv.Mat.2006.18，2553-2556)利用蛋白质修饰试剂N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)将癌靶区抗体上的氨基和Fe₃O₄磁纳米颗粒表面的羧基相连接，从而构建了靶向到癌部位的磁纳米颗粒。但是这种连接方法反应活性较低，连接到磁颗粒表面的生物分子较少。Hao Shang等人(J Am.Chem.Soc.2007.129，6640-6646)将Fe₃O₄磁微米颗粒表面的羧基氨基化，将蛋白质的伯胺通过N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯转化成巯基，随后利用N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-乙烯砜，将巯基化的蛋白质与氨基化的磁微米颗粒连接起来。但是这种连接方法中所用的N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇-乙烯砜价格昂贵。

因此，有必要寻找一种简单的磁颗粒功能化修饰方法，能够具有高的反应活性，并且，反应中所用的试剂便宜，最后，有必要在双功能化的聚乙二醇分子中加入分子量小的单功能化聚乙二醇分子，从而在长的双功能化的聚乙二醇分子将蛋白质连接到磁颗粒上后，既能给与蛋白质一定的自由度，又能保证磁颗粒的生物相容性和降低非特异性相互作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单的磁颗粒功能化修饰方法，即用于表面羧基化的磁颗粒表面功能化修饰蛋白质的方法，该方法步骤简单，操作简便，价格相对便宜，可以实现蛋白等的分离纯化，临床分子诊断，单分子磁镊技术研究蛋白分子间相互作用等的目标。

本发明的技术解决方案是：

本发明所述简单的磁颗粒功能化修饰方法，首先利用聚醚酰亚胺（PEI）将磁纳米或者微米颗粒表面的羧基官能团氨基化；随后将一端氨基甲酸叔丁酯（Boc）基团保护而另外一端为N-羟基琥珀酰亚胺的聚乙二醇（PEG）高分子偶联到氨基化的磁颗粒上；其次将蛋白的伯胺利用蛋白修饰试剂N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯（SATA）或者N-琥珀酰亚胺-3-乙酰硫代丙酸酯（SATP）修饰为巯基；最后将Boc保护基团脱除，并与巯基化的蛋白反应，从而将蛋白修饰到磁纳米或者微米颗粒上。

进一步的，本发明所述方法具体操作包括以下步骤：

1）磁颗粒表面氨基化：取表面羧基化磁颗粒溶液，通过磁铁吸引在反应器壁上，移液枪取走液体，加入碳酸盐缓冲液，超声振动分散磁颗粒，重复上述清洗过程两次，随后聚醚酰亚胺（PEI）的碳酸盐缓冲液，反应一段时间，利用碳酸盐缓冲液，清洗磁颗粒。

2）磁颗粒表面聚乙二醇化：将步骤1）得到的磁颗粒，加入氨基甲酸叔丁酯-聚乙二醇（分子量为3000）-N-羟基琥珀酰亚胺（Boc-PEG-3000-NHS）和甲氧基-聚乙二醇（分子量为2000）-N-羟基琥珀酰亚胺（mPEG-2000-NHS）混合碳酸盐缓冲液中，反应一段时间，利用超纯水溶液，清洗磁颗粒。从而将磁颗粒表面聚乙二醇化，长链双功能化PEG（Boc-PEG-3000-NHS）和短链单功能化PEG（mPEG-2000-NHS）的混合使用可以在保证在利用长链双功能化PEG来连接蛋白分子的同时，也利用长短链PEG分子的差别来保证给与所连接蛋白一定的空间自由度。

3）磁颗粒表面Boc官能团脱保护：将步骤2）得到的磁颗粒，加入适量的三氟乙酸，超声振荡，反应一段时间。利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒。

4）磁颗粒表面马来酰亚胺活化：将步骤3）得到的磁颗粒，加入蛋白交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）或者4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo-SMCC）的二甲基甲酰胺溶液中，反应一段时间。利用磷酸盐缓冲液，清洗磁颗粒。