[发明专利]百合属EST-SSR标记及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学DNA标记技术与应用领域，特别涉及4个百合属EST-SSR标记及应用。

背景技术

分子标记广泛应用于种质资源遗传多样性分析以及辅助育种工作中。百合属的分子标记研究始于1993年，然而限于科学技术发展的水平，之后的十多年在百合属植物上开发的标记主要是以随机扩增多态性DNA(RAPD)为主的第一代分子标记，这类标记重复性较差。表达序列标签(Express sequence tag,EST)中含有许多简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)，已经成为普遍认可的第二代分子标记，具有重复性好，共显性，易于检测的特点。

2008年和2011年，杨素丽和Sung-Il Lee 分别利用GeneBank公布的百合属EST序列(分别为1688条和2235条)开发了12条和19条EST-SSR标记。分子标记的数量影响着种质资源遗传多样性分析的准确性和遗传图谱构建的精确性，现有的百合属分子标记数量远远不能满足百合属分子生物学研究的需求。

为开发更多的标记，本发明利用GeneBank公布的百合属的3332条EST序列(截止2012年6月20日)以及MISA软件寻找SSR，合成了48对引物，经5类百合品种和2个野生型百合共26个不同基因型百合筛选，得到4个不同于前人的具有多态性的通用型标记。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供4个新的百合属EST-SSR标记及应用。

为了解决技术问题，增加百合属分子标记的数量以应用于今后的育种工作中，本发明提供了4个新的分子标记。所述百合属EST-SSR标记分别是一组引物对，其序列如SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 8所示。

本发明还提供了所述的百合属EST-SSR标记在百合属植物种质资源遗传多样性分析以及辅助育种中的应用。

本发明提供4个百合属分子标记，4个分子标记的特征如表1所示：

表1  百合属EST-SSR标记的特征（SEQ ID NO：1-8）

本发明4个百合属EST-SSR标记是通过下述方法得到的：

（1）利用GeneBank公布的3332条百合属EST序列和MISA软件寻找到1277个重复基元，选取其中两碱基和三碱基重复次数大于5的48个SSR序列设计了48对引物,引物设计的原则为：最终产物长度为100-230bp,引物长度为18-22bp,退火温度为60℃。在设计好的正向引物的5'端统一加18个bp的尾巴(M13- TGTAAAACGACGGCCAGT)，另合成添加了NED、PET、FAM和HEX四种不同荧光基团标识的退火温度为53℃的引物，引物委托上海英潍捷基贸易有限公司合成；

（2）用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecy trimethyl ammonium bromide)法提取白精灵、莱瑞芙和索邦三个百合品种基因组DNA；

（3）采用SSR分子标记方法进行百合分子标记的筛选：以白精灵、莱瑞芙和索邦三个百合品种基因组DNA为模板进行PCR扩增：在20μl反应体系中分别加入10×PCR buffer(Mg2+) 2μl, 2mM dNTP 0.2μl, 5U rTaq DNA polymerase 0.1μl, 正向引物0.1μl，反向引物0.5μl， 荧光标识引物0.4μl，50ng/μl DNA 模板 2μl。使用Eppendorf Mastercycler 进行DNA扩增，具体步骤为：94℃预变性5min,94℃(30s)/55℃(45s)/72℃(45s) 32个循环，之后94℃(30s)/53℃(45s)/72℃(45s) 10个循环，最后72℃延伸10min。产物检测：在含有0.5% μg/μl EB 的3% 的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。

（4）将初步筛选的有扩增产物的引物在另外26个不同基因型百合上进行扩增，于ABI遗传分析仪上进行分析，使用Gene Mapper version 4.0 读取数据，NTSYS进行分析。

本产品发明的有益效果是：