[发明专利]丽江云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法

权利要求书

1.一种丽江云杉体细胞胚胎发生与植株再生方法，其特征在于，包括：采集丽江云杉自由授粉无性系的球果，分离出成熟合子胚进行体胚发生培养；所述体胚发生培养分为四个阶段：胚性愈伤组织诱导阶段、胚性愈伤组织增殖阶段、体细胞胚成熟阶段和体细胞胚萌发阶段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织诱导阶段：采用1/2LM基本培养基，附加激素为1.1~2.2mg/L的4-二氯苯氧乙酸和0.55~1.1mg/L的6-苄基氨基嘌呤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织诱导阶段的培养基中，还包括：1~3%的蔗糖，500mg/L的谷氨酰胺，1g/L的酶解酪蛋白和0.2~0.3%的植物凝胶。

4.根据权利要求1~3任意一项所述的方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织增殖阶段：采用1/2LM液体培养基，细胞体积与培养液体积比为1:2~1:12，优选1:2~1:9；所述胚性愈伤组织增殖阶段的培养基中，附加激素为0~2.2mg/L的2,4-D和0~1.1mg/L的6-BA，优选0.55~2.2mg/L的2,4-D和0.275~1.1mg/L的6-BA。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织增殖阶段的培养基中，还包括：500mg/L的谷氨酰胺，1~4%的蔗糖和1g/L的酶解酪蛋白。

6.根据权利要求1~5任意一项所述的方法，其特征在于，所述体细胞胚成熟阶段：采用1/2LM基本培养基，附加激素为12~16mg/L的脱落酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述体细胞胚成熟阶段的培养基中，还包括：0~7.5%的聚乙二醇4000，0~1%的活性炭，0.3~0.6%的植物凝胶，6%的蔗糖，500mg/L的谷氨酰胺和1g/L的水解酪蛋白。

8.根据权利要求1~7任意一项所述的方法，其特征在于，所述体细胞胚萌发阶段：采用1/4LM基本培养基，其中还包括：250~500mg/L的谷氨酰胺，0~0.25%的活性炭，0~17.6mg/L的抗坏血酸，2%的蔗糖，1mg/L的水解酪蛋白和0.4%植物凝胶。

9.根据权利要求1~8任意一项所述的方法，其特征在于，该方法在对成熟合子胚进行体胚发生培养前，还包括：对球果进行消毒，然后在无菌的环境下取出成熟合子胚。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述消毒方式为：利用75~95%的乙醇对丽江云杉球果消毒15~20min，再用无菌水冲洗3~4次。