[发明专利]一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，特别涉及一种可以精确、特异、快速检测猪Kobu病毒，具体涉及一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒。

背景技术

猪kobu病毒(Kobu virus，PBoV)属于小核糖核酸病毒科成员，为无囊膜RNA病毒。Reuter G等于2007年2月从匈牙利某猪场健康猪群中采集60份粪便样品，经检测，检出Kobu病毒阳性39份，阳性率为65％。亚洲和欧洲的不少学者已经报道了猪Kobu病毒感染状况，表明在健康猪群和表现腹泻症状的猪群或血清样品中均检出较高的阳性率，可见其流行很广。经对猪Kobu病毒感染猪日龄的调查，表明幼龄猪较成年猪更易感。对严重腹泻仔猪采集的样本分析发现，流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒检测阳性率较低，阳性率不足5％，而猪博卡病毒(porcine bocavirus，PBoV)和猪Kobu病毒检测阳性率达到86.6％。由此可见，PBoV和Kobu病毒是这次仔猪腹泻的罪魁祸首。但到目前为止，由于对该两种病毒的认识还不够深入，尚无实时荧光定量RT-PCR检测猪Kobu病毒技术的出现，因此建立一种用于检测猪Kobu病毒的荧光定量RT-PCR方法能对该病毒进行快速诊断，对临床治疗和疾病控制有巨大的意义。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，使PCR产物的实时检测成为可能。满足实验目的的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异引物或探针；专门的热循环仪配备荧光检测模块，用于监测扩增时的荧光，检测到的荧光信号反映了每个循环扩增产物的量由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。荧光定量PCR结果可以用于定性(判断一段序列的有无)，也可以用于定量(确定DNA拷贝数)，即qPCR，而常规PCR只能做半定量。另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作，目前已得到广泛应用。基于以上优点，实时荧光定量PCR技术至发明之日起，已被广泛用于病原的检测，如猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、沙门氏菌、大肠杆菌等病原的检测。到目前为止，未发现运用实时荧光定量RT-PCR方法检测猪Kobu病毒的报道。

发明内容

针对目前检测Kobu病毒方法存在的问题，本发明目的在于提供一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒：

本发明采用如下技术方案：

一种用于检测猪Kobu病毒的检测试剂盒，

检测50个样品的试剂盒组成如下：

试剂A：TRIZOL20ml、氯仿5ml、异丙醇12.5ml、75％乙醇10ml、RNasa-free水1ml；

试剂B：5×PrimeScript Buffer 100μl、PrimeScript RT Enzyme Mix I 25μl、OligodT Primer 25μl、Random 6 mers 100μl、RNase Free dH₂O 250μl；

试剂C：上游引物P1 25μl、下游引物P2 25μl、SYBR Green I染料500μl、ddH₂O 160μl；

上游引物P1：5’-GGACCCAGACACTTACGAACA-3’；

下游引物P2：5’-TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3’。

利用试剂A抽提病毒的RNA，试剂B对其进行反转录，试剂C对其进行荧光定量PCR反应，从而对Kobu病毒进行特异性、定量检测。该方法是通过荧光染料或对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模版的初始浓度。

采用上述试剂盒进行检测的方法具体步骤如下：

1)采用常规方法提取猪Kobu病毒总RNA

2)引物设计

根据GenBank中发表的猪Kobu病毒的3D基因序列(AB624488)，设计一对特异性引物，目的基因片段为101bp，引物序列如下：

上游引物P1：5’-GGACCCAGACACTTACGAACA-3’

下游引物P2：5’-TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3’

3)猪Kobu病毒的3D基因RT-PCR扩增