[发明专利]用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒及其方法。

背景技术

支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)是寄生在呼吸道黏膜纤毛上皮细胞的一种革兰氏阴性小球杆菌，可广泛感染包括猪、犬等在内的多种哺乳动物，使呼吸道产生不显性感染及急、慢性炎症，引起诸如犬传染性支气管炎、兔传染性鼻炎等疾病，也是猪传染性萎缩性鼻炎的病原之一，人也有感染该菌的报道，尤其是小孩和免疫力缺陷的人群。支气管败血波氏杆菌于1910年由Ferry首次从患有犬瘟热的犬呼吸道中分离出来，经历四次更名，最后Moreno--Lopez才将支气管败血波氏杆菌划为波氏杆菌属。目前，波氏杆菌属分为七个种，其中将百日咳波氏杆菌(B.pertussis)，副百日咳波氏杆菌(B.parapertussis)和支气管败血波氏杆菌列为一群，而将包括禽波氏杆菌(B.avium)在内的其余四种归为另一群。

对于养猪业来讲，支气管败血波氏杆菌易与产毒素多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)混合感染，产生进行性萎缩性鼻炎，其主要表现为鼻塞、打喷嚏、流鼻血、咳嗽、呼吸不畅、颜面变形或鼻梁歪斜、生长缓慢，哺乳仔猪感染本病后，除引起鼻甲骨萎缩或消失外，还可以引起全身钙代谢障碍，致使仔猪发育迟缓，饲料利用率降低，有时伴发急、慢性支气管炎，导致仔猪死亡，给养殖业带来严重的经济损失。实验室通常的诊断方法是用聚合酶链式反应(PCR)，该方法虽然灵敏、特异，但是成本较高且需要专门的PCR仪，而且到目前为止，尚无有效的检测试剂盒问世，因此研制支气管败血波氏杆菌检测试剂盒能对该病进行快速诊断，对临床治疗和疾病控制有巨大的意义。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由T.Notomi于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65℃左右等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸扩增，由于其扩增依赖于目的序列的四个特异性区域，因此其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高，而且由于该反应在恒温条件下进行，因此不需要昂贵的仪器，而使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，另外扩增反应可以在一个小时之内完成，所需时间短，且其反应产物易于观察，扩增结果可直接通过对扩增副产物焦磷酸镁沉淀进行肉眼观察判断。基于以上优点，LAMP从发明之日起，已被广泛用于病原的检测，如大肠杆菌、猪传染性胸膜肺炎、沙门氏菌、结核杆菌、禽流感、疱疹病毒等细菌性疾病和病毒性疾病的检测，但是到目前为止，未发现运用LAMP方法检测支气管败血波氏杆菌的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测支气管败血波氏杆菌的LAMP试剂盒并提供一种用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒及其方法。

一种用环介导等温扩增方法检测支气管败血波氏杆菌的试剂盒，该试剂盒包括：

环介导等温扩增反应液，23μL/份，其组成如下：

1μL浓度为8U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液，浓度为5μmol/L的上游内引物FIP和下游内引物BIP各1μL，浓度为25μmol/L的上游外引物F3和下游外引物B3各1μL，2μL浓度为100mM的MgSO₄，5μL浓度为10mM的dNTP，5μL浓度为5M的甜菜碱，3.5μL的无菌水；

其中聚合酶缓冲液含有200mM Tris-HCl(pH8.8)，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM的MgSO₄，1％Triton X-100；

所述的引物序列为：

上游外引物F3：CCTTTGCCGCCAGATTCC

下游外引物B3：GCTCCCAAGAGAGAAAGGC

上游内引物FIP：TGGATTACGGCAGGTTTGCGA-CCCGCACATTTCCGAACT

下游内引物BIP：GGCAACAAAGGAAATCGCGGC-TCTTCAAACCGGGCAGCT

使用所述试剂盒检测支气管败血波氏杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)波氏杆菌DNA的提取