[发明专利]一种可维持细胞活性的组织冻存液

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种可维持细胞活性的组织冻存液。

背景技术

低温冷冻保存是活体组织长期保存的一种有效方法，主要通过降低细胞的代谢率来起到保护作用，冻伤是低温保护最大的负反应，其原因可能为冰晶所致的机械性损伤和渗透性损伤。目前组织的冻存主要有两种方法：快速冻存法，即玻璃化法；慢速冻存法，即程序降温法。慢速冻存法较为常用。但是如果没有采取合适的冻存方法和合适的冷冻保护剂，组织在冻存过程中容易被冻伤

超低温冷冻保存是在液氮(-196℃)中使保存的活细胞物质代谢和生长几乎完全停止的保存方法。在这样冷冻的条件下，调节和控制细胞生长代谢的各类酶的作用受到极大抑制，使细胞内部的生化反应十分缓慢，甚至停止，从而避免细胞遗传性状的改变，细胞和组织不会丧失形态发生的潜能。但是，单纯的超低温保存会对细胞造成两方面的损伤。其一，在低温保存的过程中，细胞外部的水分首先结冰，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，造成细胞死亡，这种因保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤；其二，随着温度的降低,细胞内的水分也会结冰，所形成的冰晶进一步破坏细胞膜和细胞器，这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。影响损伤程度的因素主要有冷冻速度、融冻速度及冷冻保护剂。

冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，一般可分为渗透性与非渗透性两类。一般非渗透性保护剂是大分子聚合物，不能渗透到细胞内部，通过稀释胞外电解质的浓度，减少溶质损伤和结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶损伤。常用的有：蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖(dextran)、白蛋白(albumin)及羟乙基淀粉(hydroxyephylstarch，HES)等。而渗透性保护剂则主要为小分子物质，多易溶于水，与水分子结合的能力强，易穿透细胞膜进入细胞内部，在细胞内能降低细胞的冰点；并提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成；复苏时促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤；稀释未结冰溶液中电解质的浓度，减少溶质损伤。主要有以下几种：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇、乙二醇等。

在前两种因素冷冻速度和融冻速度受目前工艺条件的限制，无法在短期内有较大改进的前提下，冷冻保护剂的正确选择及应用就成为了决定冻存效果的最关键因素。

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。采用合适的方法冻存脂肪组织,并从中取得干细胞,可以为临床应用提供良好的条件，因此本领域迫切需要开发新颖有效的且适合脂肪组织的冻存液。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效的可用于脂肪组织的冻存液及脂肪组织的冻存方法。

在本发明的第一方面，提供一种冻存液，包含以下组分：海藻糖、二甲基亚砜和血清替代物KSR。

在另一优选例中，所述海藻糖的浓度为0.05~2mol/l；所述二甲基亚砜与所述血清替代物KSR的体积比为1:1~10。

在另一优选例中，所述海藻糖的浓度为0.1~0.5mol/l；所述二甲基亚砜与所述血清替代物KSR的体积比为1:1~5。

本发明的冻存液可以由海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR混合均匀后配制而成，其中，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为0.5~20mol/l，所述海藻糖的KSR溶液，二甲基亚砜与KSR的体积比为1-4：1-4：13-18。

在另一优选例中，所述海藻糖的KSR溶液的浓度为0.5~10mol/l，较佳地为05~8mol/l。

在另一优选例中，所述二甲基亚砜与KSR的体积比为1-4：1-4：13-18；较佳地，二甲基亚砜与KSR的体积比为1-1.5：1-1.5：9-11。

本发明的第二方面，提供第一方面所述的冻存液的用途，被用于长期保存脂肪组织和/或建立脂肪组织库。

本发明的第三方面，提供一种脂肪组织混合物，所述混合物包括以下组分：

脂肪组织，和

第一方面所述的冻存液。

在另一优选例中，所述脂肪组织与所述冻存液的体积比为1:0.5-5，较佳地，为1:0.8-2。

在另一优选例中，所述脂肪组织与所述冻存液的体积比为1:1-1.5。