[发明专利]利用细菌核酸指纹特征谱库进行鉴定和分类的用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌核酸指纹图谱制备的方法，以及使用该方法，对细菌进行分类与鉴定的方法。

背景技术

早期的细菌学分类主要是采用以形态培养特征和生理生化特征为依据的传统细菌学分类方法。但是由于细菌的这种表面特征往往受很多人为因素的影响与限制，特别是人们主观判断的差异反而难以反映出细菌的自然亲缘关系，这就体现了只建立在形态特征和生理生化特征基础上的传统分类学的局限性。

因此，Colweel提出了一个新的细菌分类学术语“多相分类（Polyphasic taxonomy）”，它是指综合利用微生物多种不同信息，包括表型和基因型的信息进行分类的方法。分子分类和系统发育信息丰富了多相分类的内容，共同推动细菌分类向着自然分类系统靠近。应用于分类的分子指标主要为DNA和RNA，而DNA同源性分析是确定正确的分类地位，建立自然分类系统的最直接的方法。此类方法简便易行，分辨率高，在细菌系统分类学研究中起着越来越重要的作用。

使用质谱技术进行细菌分类和鉴定的原理在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，对细菌基因组DNA上某个或某几个片段进行PCR和酶切后，将产生分子量和丰度各异的片段，使用质谱检测可产生核酸指纹图谱，不同细菌之间基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱，建立数据库后，可以实验结果与数据库进行比对，即可完成对细菌的鉴定。

已有一些公开文献使用质谱技术对微生物进行分类和鉴定，例如，中国专利申请CN102337223A、“产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制备方法”，公开了一种检测产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-TOF鉴定方法，其中从平板上挑取产黄青霉A096孢子接种于SGY液体培养基培养，预处理得到粗蛋白溶液在色谱柱上分离纯化，并在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，各组分离心超滤浓缩至所需体积，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分判断获得蛋白的纯度；割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，进行MALDI-TOF鉴定。该方法仅适用于特定微生物，且需要多重蛋白纯化过程，最终用MALDI-TOF鉴定特征蛋白Pc-Arctin，其过程繁琐、适用面窄，不能实现质谱分类细菌或微生物的目的。

中国专利申请200910157210、“一种李斯特菌属细胞中脂肪酸组分的分析方法”公开了一种利用气相色谱质谱(GC-MS)分析法针对细菌脂肪酸进行分类的方法，包括：李斯特菌复壮，用牛津琼脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂平板分别分离和纯化李斯特菌，培养单个典型菌落的李斯特菌并制成菌悬液，用甲醛灭活处理，把经甲醛处理后的菌悬液平均分装在离心管洗涤，用盐酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸进行气相色谱质谱(GC-MS)分析。虽然该方法打破传统细菌分类学的局限，减少人为因素对传统形态分类带来的误差，同时为新的菌种和毒种的分类鉴定提供强有力的工具，但该法仍然属于利用质谱法进行细胞化学分析分类，并未针对核酸进行检测。

国际专利申请WO2010/021548、“Method for identifying biological material e.g. bacteria in sample of patient, involves separating stream of liquid containing sample into successive portions to form flying drops and ionizing flying drops to measure mass spectra”，公开了一种使用MALDI-MS(基质辅助激光解吸和电离质谱)用于识别生物材料的方法和装置，包括准备包含试样和MALDI基质材料的液体，并将其用于形成液体的连续流束。将该流束分散成接连的部分，以形成发射到飞行中的液滴，或将流束发射到飞行中，然后分散成液滴。可使用从喷墨印刷机中已知的液滴形成技术。对飞行中的液滴电离出材料。测量来自各个液滴的电离材料的质谱。但该方法目的在于如何改善MALDI-MS检测生物物质的灵敏度，并不涉及质谱鉴定和分类任意微生物，因此也不能解决上述技术问题。