[发明专利]微核酸-196a分子及-196b分子侦测口腔癌的方法及其引物、探针与试剂盒

说明书

技术领域

本发明提供一种将微核酸-196a(miR-196a)分子及微核酸-196b(miR-196b)分子运用于侦测口腔癌的方法，尤其以miR-196a分子及miR-196b分子作为口腔癌的肿瘤标记，分析潜在病患的生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量来推断该潜在病患罹患口腔癌的方法。 

背景技术

血液肿瘤标志具有疾病侦测、预后及监控治疗结果的价值。因此，一个临床上应用的血液型肿瘤标志可以提供更好的疾病控制。现行的血液型肿瘤标志有侦测大肠直肠癌的CEA、侦测肝癌的AFP与侦测摄护腺癌的PSA，过去也有报导指出SCC抗原与Cyfra21可以作为头颈癌的侦测标志，但目前尚未提到有临床使用的口腔癌侦测标志。此外，微核酸(miRNA)是内生性，不转译蛋白的小片段RNA，其利用结合到标的基因讯息RNA的3’不转译区域(3’UTR)，进而抑制标的基因转译而达到负向调控基因表达。微核酸被认为是一群重要的基因调控分子，估计有1/3-1/2的人类基因会受微核酸调控，此外每个微小RNA亦可以同时调控不同的标的基因。已知微核酸参与多样的生物功能，如细胞增生、分化、凋亡及移行功能，甚至微核酸表达异常也认为与细胞恶性转化有关。近年来研究显示，许多不同的癌症都有其特异的微核酸表达，然而研究显示共同的结果并不多，表示微核酸的复杂性及其机制并未被真正了解。 

目前口腔癌是十大癌症之一，每年约以五十万人的新病例增加，为改善医疗成效，提升口腔癌患者的存活率，除了改善治疗的方式外，发现并建立一个临床上可以用来侦测以及监控病程的肿瘤标志，可有效减少口腔癌病人的死亡率。 

发明内容

目前并无适当的分子肿瘤标志，可应用于口腔癌的临床侦测，为了改善医疗成效，提升口腔癌患者的存活率，本发明提供一种以将微核酸-196a(miR-196a)分子及微核酸-196b(miR-196b)分子运用于侦测口腔癌的方法，是分析潜在病患的肿瘤组织、血浆、血清、口水或漱口水等生物检体中miR-196a分子及miR-196b分 子的表达量，其中miR-196a分子具有SEQID NO：1所示的核苷酸序列，miR-196b分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，若miR-196a分子或miR-196b分子的表达量异常高于正常值(其中，miR-196a的正常值为1.817±0.38，miR-196b的正常值为7.683±1.88)，即可推断该潜在病患罹患口腔癌。 

以血浆检体为例，又本发明分析潜在病患的生物检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量的分析步骤为：步骤一：首先取得血浆检体，将血浆样分装出200μl，用可纯化miRNA的试剂组来萃取出微核酸(miRNA)，第一步加入700μl QIAzol使其均质化后再加入140μl氯仿分离萃取RNA，离心之后取上清液(约525μl)加入750μl纯乙醇沉淀核酸产物，然后用离心管柱分离出沉淀物，丢弃下层流出液，在润洗管柱后，每个样本用20μl无核酸水解酶(RNase-free)的水将核酸提取出来；步骤二：微核酸(miRNA)的定量，微核酸的定量方式是用反转录实时荧光定量PCR反应试剂进行，首先将所萃取的核酸取3μl进行反转录反应，30μl反应体系包含4单位的反转录酶、10单位的核酸水解酶抑制剂及25mM dNTP，置于37℃孵育30分钟，接着用实时荧光定量PCR检测仪进行实时荧光定量PCR检测，方法为：将8μl反转录后的产物与1μl上述用于侦测miR-196a分子或miR-196b分子表达量的引物和探针混和，并加入6μl水和10μl实时荧光定量PCR试剂后上机，结果以Ct值(threshold cycle)显示，以已知浓度的miR-196a分子及miR-196b分子的检测结果为对照，根据对照的Ct值及检体的Ct值，得到检体中miR-196a分子及miR-196b分子的表达量。 

本发明一种用实时荧光定量PCR法侦测miR-196a分子和miR-196b分子表达量的引物和探针，其中，检测miR-196a的上游引物、下游引物及探针序列存在于Applied Biosystems- MicroRNA Assays试剂盒(miR-196a：000495)中，检测miR-196b的上游引物、下游引物及探针序列存在于Applied Biosystems- MicroRNA Assays试剂盒(miR-196b：002215)中。