[发明专利]检测单头烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测单头烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的试剂盒。

背景技术

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）是引起番茄生产上一种毁灭性病害“番茄黄化曲叶病毒病”的重要毒源，已给我国的番茄生产造成了严重的经济损失。该病毒的传播介体为烟粉虱（Bemisia tobaci Gennadius)，烟粉虱在作物和蔬菜以及杂草上发生十分普遍，危害十字花科、葫芦科、豆科、茄科、锦葵科等植物，为害的主要经济作物有棉花、烟草、番茄、甘薯等。烟粉虱经刺吸植物获毒后终生带毒。在保护地栽培条件下，烟粉虱在北方能够安全越冬并成周年发生，由于烟粉虱个体微小，繁殖能力强，且生产上难以根除，已成为导致番茄黄化曲叶病快速扩展和大流行的重要原因。检测烟粉虱是否带毒是进行番茄黄化曲叶病毒病预测和综合防治的关键技术和措施。

在番茄黄化曲叶病毒病的综合防治中，使用无毒番茄幼苗和监测烟粉虱带毒情况是成功进行综合防治的关键，单头带毒的烟粉虱刺吸番茄植株即可造成病害，随即造成病害流行和大发生，给番茄生产造成毁灭性灾害，鉴于此，必须及时、快速、简便地对烟粉虱进行带毒检测，这就需要开发一种简单、快速、灵敏的检测方法用于单头烟粉虱是否携带TYLCV。

目前检测烟粉虱是否携带TYLCV常见的有2种方法，一是分子生物学检测方法，主要是利用PCR方法，但PCR检测耗时，产物不便检测，操作繁琐，反应需要PCR仪和特殊试剂，不适于生产一线使用。二是血清学检测方法，主要是ELISA方法，但ELISA的检测灵敏度上以及特异性不高，不适于快速准确检测。现有技术的不足主要有：一是现有的引物不适于我国发生的TYLCV的检测，使得检测效率低，假阴性率高；二是目前的技术需要提取DNA，过程复杂，不易推广应用；三是现有技术不能适于单头烟粉虱简便快捷检测。

近几年逐渐发展起来的环介导恒温扩增技术（Loop mediated isothermal amplification,LAMP）以快速高效、简便易行、灵敏特异等优势正在被用于病原微生物的检测工作中。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测番茄黄化曲叶病毒的环介导等温扩增引物组。

本发明提供的引物组，包括引物1、引物2、引物3和引物4；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

上述引物组由引物1、引物2、引物3和引物4组成，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的摩尔比具体为1：1：8：8。

本发明的另一个目的是提供一种检测番茄黄化曲叶病毒的环介导等温扩增试剂。

本发明提供的环介导等温扩增试剂，包括上述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱和水。

上述环介导等温扩增试剂还包括DNA聚合酶，所述环介导等温扩增试剂由上述的引物组、环介导等温扩增缓冲液、dNTPs、硫酸镁、DNA聚合酶、甜菜碱和水组成；所述引物1和所述引物2在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均具体为0.2μmol/L，

所述引物3和所述引物4在所述环介导等温扩增试剂中的终浓度均具体为1.6μmol/L。

本发明的第三个目的是提供一种检测番茄黄化曲叶病毒的环介导等温扩增试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的环介导等温扩增试剂。

上述的引物组、上述环介导等温扩增试剂或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测烟粉虱中是否携带番茄黄化曲叶病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述环介导等温扩增反应的温度为63-65℃，所述环介导等温扩增反应的时间为45-60分钟。

上述检测和/或辅助检测待测烟粉虱中是否携带番茄黄化曲叶病毒为用上述环介导等温扩增试剂对待测烟粉虱进行环介导恒温扩增反应，检测环介导恒温扩增反应产物；

所述检测环介导恒温扩增反应产物的方法为如下1）或2）：

1）将所述环介导恒温扩增反应产物中加入染色剂反应5min，得到染色后反应产物；若染色后反应产物的颜色为绿色，则待测烟粉虱携带或候选携带番茄黄化曲叶病毒，若染色后反应产物的颜色为橙色，则待测烟粉虱不携带或候选不携带番茄黄化曲叶病毒；