[发明专利]抗CD2蛋白单克隆抗体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及可特异结合CD2蛋白的单克隆抗体，及其在检测CD2蛋白中的应用。

背景技术

CD2也称为LFA-2、LEU-5或绵羊红细胞受体，分子量为45-58kD的单体分子，属免疫球蛋白超家族成员，可存在于成熟T细胞及胸腺细胞膜表面，也可表达于NK细胞。CD2分子是细胞间的粘附分子，也是信号传导分子。免疫组化实验下表达情况为：（1）所有T淋巴细胞和NK细胞可表达，B淋巴细胞不表达；（2）正常骨髓细胞或正常肥大细胞不表达，但肥大细胞增生症的肥大细胞可表达。因此，CD2分子可作为一种广谱的T细胞标志物，用于正常T细胞以及T细胞来源肿瘤的鉴别。在临床上，CD2蛋白可用于T细胞型急性淋巴细胞白血病（T-ALL）以及其它T细胞恶性肿瘤的辅助诊断。

目前临床上通常通过免疫组织化学（IHC）病理实验检测肿瘤细胞中CD2的表达状况。IHC实验的核心为特异性结合CD2的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对CD2蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供一种结合特异性较高的抗CD2蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测CD2蛋白的免疫检测工具中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称为CGMCC），保藏日期为2012年5月16日，保藏编号为CGMCC No.6132。

本发明还提供了一种特异性结合CD2蛋白的单克隆抗体9D1，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

（1）重组表达载体的构建：根据CD2基因的ORF全序列（如SEQ ID No.1所示）设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，并在其C末端引入Myc-DDK标签序列（如SEQ ID No.2所示），插入表达载体pCMV6-Entry，构建CD2重组表达质粒；

（2）CD2重组蛋白的表达与纯化：以该质粒转染HEK293T细胞，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的CD2重组蛋白；

（3）单抗的筛选与制备：采用上述纯化的CD2重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗CD2特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为9D1，亚型鉴定为IgG1；制备小鼠腹水，通过亲和层析柱纯化CD2单抗。分别通过Western Blot、免疫组化实验、免疫荧光验证该单抗的灵敏度和特异性。

上述单克隆抗体的特异性验证：

OriGene高密度蛋白芯片上包含10400个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵，每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。

将本发明单克隆抗体9D1与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示：本发明单克隆抗体9D1特异性结合CD2蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。

本发明还提供了单克隆抗体9D1在制备用于检测CD2蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体9D1；可检测组织细胞中CD2的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于鉴别T细胞或T细胞来源肿瘤的试剂盒中的应用。CD2分子作为一种广谱的T细胞标志物，可用作T细胞的鉴定；另外，CD2分子同样可作为分辨T细胞来源肿瘤的生物标志物。临床上，检测CD2蛋白可用于T细胞型急性淋巴细胞白血病（T-ALL）以及其它T细胞恶性肿瘤的辅助诊断。

所述T细胞来源的肿瘤为T细胞白血病或T细胞淋巴瘤，所述T细胞白血病为T细胞型急性淋巴细胞白血病（T-ALL）。

保藏信息

用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为：抗人CD2单克隆抗体杂交瘤细胞株9D1；

保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏单位简称：CGMCC；